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第42卷第8期                       马泽萌，陈允梓. 维生素D受体核定位信号的鉴定［J］.
                  2022年8月                    南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1073-1079                      ·1075 ·


                过夜，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗免多聚抗                            组定量资料比较采用单因素方差分析（one⁃way
                体，室温孵育 1 h。最后采用 ECL 化学发光法检测，                      ANOVA）检验，多组间数据两两比较采用 LSD 法。
                在蛋白分析仪拍摄下进行结果分析。                                  两组定量数据比较用 t 检验。P < 0.05 为差异有统
                1.2.4 免疫荧光分析                                      计学意义。
                    细胞样品采用 4%多聚甲醛固定，室温 15 min，
                                                                  2  结 果
                PBS清洗2遍，再用0.02% NP⁃40处理15 min。然后
                用QuickBlock 免疫染色封闭液封闭15 min，进行一                   2.1  VDR核定位信号的预测
                            TM
                抗 HA 抗体孵育，4 ℃过夜。次日，PBS（含 0.5% Tri⁃                    为了初步确定VDR的核定位信号位置，借助在
                tion X⁃100）清洗后，加入荧光标记的二抗室温孵育                      线 预 测 网 站 对 VDR 氨 基 酸 全 序 列 进 行 了 分 析
                1 h。最后复染 DAPI，细胞样品进行荧光显微镜的                       （http：//nls ⁃ mapper.iab.keio.ac.jp/cgi ⁃ bin/NLS_Map⁃
                图像采集并分析。                                          per_form.cgi），预测结果显示核定位信号序列为
                                                                                   61
                1.3  统计学方法                                        49 RRSMKRKALFLT （图 1A）。对不同物种来源的
                    实验数据用 GraphPad Prism 7.0 软件进行统计               VDR进行序列比对，发现预测的核定位信号序列具
                学分析，各组数据用均数±标准差（x ± s）表示，多                        有很好的保守性（图1B）。


                     A
                                         Predicted NLSs in query sequence              Predicted monopartite NLS
                                                                                     Pos.   Sequence  Score
                        MEAMAASTSLPDPGDFDRNVPRICGVCGDRATGFHFNAMTCEGCKGFFRR  50
                        SMKRKALFTCPFNGDCRITKDNRRHCQACRLKRCVDIGMMKEFILTDEEV  100
                                                                                      49  RRSMKRKALFT  10
                        QRKREMILKRKEEEALKDSLRPKLSEEQQRIIAILLDAHHKTYDPTYSDF 150
                        CQFRPPVRVNDGGGSHPSRPNSRHTPSFSGDSSSSCSDHCITSSDMMDSS  200
                        SFSNLDLSEEDSDDPSVTLELSQLSMLPHLADLVSYSIQKVIGFAKMIPG 250
                        FRDLTSEDQIVLLKSSAIEVIMLRSNESFTMDDMSWTCGNQDYKYRVSDV  300
                        TKAGHSLELIEPLIKFQVGLKKLNLHEEEHVLLMAICIVSPDRPGVQDAA 350
                        LIEAIQDRLSNTLQTYIRCRHPPPGSHLLYAKMIQKLADLRSLNEEHSKQ 400
                        YRCLSFQPECSMKLTPLVLEVFGNEIS
                     B                                      122             426
                                                 1
                                                        NBD           LBD
                                                    16         124              427
                                             Human        43⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃GCKGFFRRSMKRKA⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃56
                                             House mouse  43⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃GCKGFFRRSMKRKA⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃56
                                             Noway rat    43⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃GCKGFFRRSMKRKA⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃56
                                             Chicken      66⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃GCKGFFRRSMKRKA⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃79
                                             Dog          43⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃GCKGFFRRSMKRKA⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃56
                   A：根据核定位分析网站 http：//nls⁃mapper.iab.keio.ac.jp/cgi⁃bin/NLS_Mapper_form.cgi，预测VDR的核定位信号；B：分析VDR的核定位信号
                种属保守性。
                                                     图1 预测VDR核定位信号
                                         Figure 1 Predicting the nuclear localization signal of VDR


                2.2  VDR突变体的构建                                    K53Q/R54G/K55E）转染 HEK 293T 细胞进行表达。
                    根据预测的结果和文献报道             ［10］ ，针对VDR核定        在VD 100 nmol/L处理前后，分别获取细胞样品进行
                位序列中的保守氨基酸精氨酸（R）和赖氨酸（K）进                          核质分离，并采用Western blot 分析，其中Tubulin为

                行点突变设计，采用点突变试剂盒（Mut Express Ⅱ                     胞质内参，Lamin B为胞核内参。结果表明，VD处理
                Fast Mutagenesis Kit V2）以质粒 pCMV⁃HA⁃VDR 为         能诱导野生型 VDR 转位细胞核内（图 3A），而 VDR

                模板，构建了一系列突变体（R49W/R50G、K53Q/                      突 变 体 VDR（R49W/R50G），VDR（K53Q/R54G/
                R54G/K55E 和 R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E），通           K55E）和VDR（R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E）的表
                过 Vector NTI 软件对测序结果进行分析，结果显示                     达主要停留在胞质中，不能被 VD 诱导转位入细胞
                VDR突变体成功引入突变点（图2）。                                核（图3B~D）。由此可见，在预测的NLS里这些保守

                2.3  VDR点突变抑制其入核能力                                位点的突变抑制了VDR进入细胞核，初步确定它们
                    为了验证点突变是否对VDR核定位产生影响，                         是VDR入核的关键位点。
                将 VDR 突变体（HA⁃VDR、HA⁃VDR⁃R49W/R50G、                    接着，采用免疫荧光法直接观察VDR点突变对

                HA⁃VDR⁃K53Q/R54G/K55E、HA⁃VDR⁃R49W/R50G/           其空间分布的影响。在HeLa细胞中转染VDR及其
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