Page 34 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第8期
·1076 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年8月

HA⁃VDR、HA⁃VDR（R49W/R50G）、HA⁃VDR（K53Q/R54G/K55EP）、HA⁃VDR（R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E）的测序结果比对。
图2 构建VDR点突变
Figure 2 Constructing VDR point mutations

A HA⁃VDR NC B HA⁃VDR（R49W/R50G） NC
细胞质 细胞核 0.8 VD 0.3
*** 细胞质 细胞核 VD
VD - + - + 0.6 VD - + - +
VDR/内参 0.4
VDR 51 kDa VDR 51 kDa 0.2
Tublin 50 kDa Tublin 50 kDa VDR/内参
LaminB 70 kDa 0.2 LaminB 70 kDa 0.1
0 0
细胞质 细胞核
细胞质 细胞核
C D
HA⁃VDR（K53Q/R54G/K55E） 0.5 NC HA⁃VDR（R49W/R50G/ 0.5 NC
细胞质 细胞核 0.4 VD K53Q/R54G/K55E） 0.4 VD
VD - + - + 细胞质 细胞核
VDR 51 kDa VDR/内参 0.3 VD - + - + VDR/内参 0.3
Tublin 50 kDa 0.2 VDR 51 kDa 0.2
0.1 Tublin 50 kDa 0.1
LaminB 70 kDa
0 0
细胞质 细胞核 LaminB 70 kDa 细胞质 细胞核
在HEK 293T细胞中瞬时表达HA⁃VDR（A）、HA⁃VDR（R49W/R50G）（B）、HA⁃VDR（K53Q/R54G/K55E）（C）、VDR（R49W/R50G/K53Q/R54G/
K55E）（D）后，采用VD（100 nmol/L）处理 4 h，收集VD刺激前后的细胞样品进行胞质和胞核的分离，Western blot分析各组分中VDR及其变体
的蛋白水平，并采用Image J 软件定量分析Western blot结果，两组比较， P < 0.001。
***
图3 VDR的点突变抑制其核定位
Figure 3 VDR point mutations inhibit the transfer of VDR to the nucleus

突变体载体，观察这些蛋白的表达在 VD 刺激前后 100 nmol/L VD 处理，收集细胞样品进行 qPCR 检
在细胞空间上的分布差异，以DAPI 标记细胞核，红 测。如图5所示，在VDR 表达的细胞里，VD 可以有
色荧光标记 HA⁃tag 指示 VDR 及变体的所在位置。 效诱导 Cyp24a1 mRNA、Atp2b1 mRNA 水平上调；而
如图 4 结果所示，在 VD 刺激下，野生型 HA⁃VDR 发 在 VDR 点突变表达的细胞中，VD 诱导 Cyp24a1
生明显转位进入细胞核，而 VDR 突变体在 VD 刺激 mRNA、Atp2b1 mRNA 表达的能力显著降低，说明
前后，细胞内的空间分布并未发生明显变化，与上 VDR 的点突变能削弱了 VD 的生物学功能，不能有
述 Western blot 结果一致，表明这些点突变位点是 效响应VD信号启动下游基因的转录。
VDR核定位的关键位点。
3 讨 论
2.4 VDR点突变减弱了对下游基因表达的调控
VD 的生物学功能主要由 VDR 下游基因实现。 VDR的活性受VD调控，在一些疾病如癌症、神
Cyp24a1、Atp2b1 是 VDR 调控的下游基因 ［13- 14］ ，而 经系统疾病、免疫性疾病的研究中已成为预防、诊断
Cyp27A 不 受 VDR 调 控 作 为 阴 性 对 照 。 在 HEK 和治疗的重要靶点分子 ［15-19］ 。VD 与 VDR 结合能激
293T 细胞里瞬时表达 HA⁃VDR 及点突变体，采用 活VDR入核发挥转录因子功能，确定其NLS有助于