Page 66 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第8期
·1108 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年8月

模型的一个显著优势是移植后的肿瘤在借助移植 购自南京医科大学医药实验动物中心。NOD 小鼠
受体提供维持其在体内生长所需营养支持的情况 购自北京维通利华生物技术有限公司和南京大学
下，保留了患者肿瘤包括肿瘤细胞的基因表达谱和 模式生物研究所。
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异质性等关键特征 ［3-4］ ，从而在药效评价 、生物标 MESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit 试 剂 盒
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志物的筛选 和预测患者对药物响应程度 等研究 （AM1345，Ambion 公司，美国），HiScribe TM T7 High
中都具有很高的应用价值。为成功建立PDX模型， yield RNA Synthesis Kit 试剂盒（E2040S）、各种限制
需要选择合适的免疫缺陷小鼠品系作为肿瘤组织 性内切酶、T4 DNA 连接酶（M0202S）（NEB 公司，美
移植的受体，裸鼠、SCID以及NOD/SCID等一系列免 国），胶回收试剂盒（9762，TaKaRa公司，日本），小鼠
疫功能高度低下的小鼠被尝试用作人类肿瘤异种移 组织 DNA 抽提试剂盒（PD101⁃01）及 PCR 相关试剂
植的标准受体。NOG/NSG小鼠是免疫功能最差的小 （P213⁃03）（南京诺唯赞），血清（Hyclone 公司，美
鼠，对正常和恶性人体组织的移植效率最高 。然 国），RPMI 1640 培养基（Gibco 公司，美国），DMSO
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而，受到技术壁垒和使用限制，NOG/NSG 的售价相 （Sigma公司，美国）。
对较高（在日本用于学术用途的每只小鼠售价为 1.2 方法
100美元），而且用户不能自行繁育这些小鼠。本研 1.2.1 CRISPR敲入方案的设计
究团队通过采用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，构建 小鼠 Prkdc（16 Chr，gene ID：19090，NCBI Refer⁃
了 NOD 背景的 Prkdc 和 Il2rg 双敲除免疫缺陷小鼠， ence Sequence：NC_000082.7）和 Il2rg（X Chr，GENE
命名为NYG小鼠，为肿瘤研究和药物评估提供了良 ID：16186，NCBI Reference Sequence：NC_000086.8）
好的PDX模型。 基 因 组 序 列 来 自 NCBI，CAS9 设 计 软 件 来 自
CRISPOR.ORG，采 用 http：//crispr.dbcls.jp 和 http：//
1 材料和方法
asia.ensembl.org/Multi/Tools/Blast 进行脱靶分析，每
1.1 材料 个基因分别设计2个靶点（表1），设计的靶序列构建
pX330 ⁃ U6 ⁃ Chimeric_BB ⁃ CBh ⁃ hSpCas9 质 粒 至 PT7⁃CRISP 载体（自构），经测序验证后，用 HiS⁃
（Plasmid#42230）由美国Addgene公司提供。实验动 cribe T7 High yield RNA Synthesis Kit 试剂盒体外
TM
物均在南京医科大学医药实验动物中心屏障中饲 合成 sgRNA。PX330 质粒（Addgene）扩增全长 Cas9
养繁殖，符合南京医科大学实验动物伦理管理规范 基因，用 MESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit 试剂盒
（伦理号：IACUC⁃2011031）。ICR 小鼠受体、结扎鼠 转录Cas9 mRNA，-80 ℃保存待用。

表1 目标靶点信息
Table 1 Target information

靶点名称 靶点序列+PAM T7体外转录重叠PCR引物序列
mPrkdc⁃sgRNA1/fw CGAGCTGTTCAGAAACACCA AGG ATAATACGACTCACTATAGGCGAGCTGTTCAGAAACACCA
GTTTTAGAGCTAGAAATAG
mPrkdc⁃sgRNA1/fw ACTGGAGGAAGTGTGATTCA TGG ATAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGAAGTGTGATTCA
GTTTTAGAGCTAGAAATAG
mIl2rg⁃SG1/rev ACAGCCAGAAGTAATCTCTT TGG ATAATACGACTCACTATAGGACAGCCAGAAGTAATCTCTT
GTTTTAGAGCTAGAAATAG
mIl2rg⁃SG2/fw GACATTTGTTGTCCAGCTCC AGG ATAATACGACTCACTATAGGACATTTGTTGTCCAGCTCC
GTTTTAGAGCTAGAAATAG
下划线为识别的靶点序列。
1.2.2 显微注射与胚胎移植 1.2.3 F0代小鼠的基因型鉴定

将 Prkdc 及 Il2rg sgRNA 、Cas9 mRNA 用无 RNA 受精卵移植的假孕母鼠单笼饲养20 d后，观察
酶水混合稀释至终浓度为20、50 ng/μL，将混合液用 出生情况。小崽长至 7 d，趾标法进行小鼠编号。
显微操作仪注射入 NOD 小鼠 0.5 d 受精卵雄原核 剪下的脚趾以鼠尾组织标本试剂盒提取基因组 DNA，
中，注射完成后将受精卵吸入预热的 M16 液滴中， 进行PCR鉴定。PCR条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃
清洗3遍，植入0.5 d的假孕ICR小鼠输卵管中。 变性 30 s，55 ℃退火复性 30 s，72 ℃延伸 30 s，扩增