Page 67 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第8期 尹 媛，曾文滔，周建丽，等. Prkdc和Il2rg双敲除免疫缺陷小鼠的构建和初步应用［J］.
2022年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1107-1111 ·1109 ·

35 个循环，PCR 产物直接送苏州金唯智生物科技 冻。皮下移植的肿瘤，每 7 d 测量 1 次肿瘤的长径
术有限公司测序，测序序列用GENESNAP软件分析 （L）与短径（W），计算肿瘤体积，肿瘤体积计算公式
靶序列，选择阳性小鼠传代建系。鉴定引物序列如 为 V=1/2×（L×W），绘制肿瘤生长曲线，当肿瘤长径
2
下 ，mPrkdc ⁃ tF：5′ ⁃ GCCTGGCTGAAAGTGTAT ⁃ 3′ ， 达到1 cm时传代或冻存。
mPrkdc ⁃ tR：5′ ⁃ TTCAAGGCAGGTTAGGAC ⁃ 3′ ； 1.2.6 组织病理分析
mIl2rg⁃tF：5′⁃TGAGGACCCAATCAAGTG⁃3′，mIl2rg⁃ 临床剩余肿瘤组织和 PDX 模型分离的肿瘤组
tR：5′⁃GGCTACTTCTTTCCCGATTA⁃3′。 织经中性福尔马林固定制备组织切片，用HE染色，
1.2.4 流式分析B细胞、T细胞和NK细胞 比较患者肿瘤组织与PDX模型肿瘤组织异同。
取8周龄NYG 小鼠和野生型BALB/C 经尾静脉
2 结 果
采集外周血细胞100 μL，直接免疫荧光抗体标记法
染 色 ，用 流 式 细 胞 仪 检 测 分 别 用 CD3、CD19 和 2.1 NYG纯合子小鼠的获得和基因型的PCR鉴定
NKp46表达情况，用比对T、B和NK细胞的组成。 将sgRNA 、Cas9 mRNA原核注射至受精卵细胞
1.2.5 NYG小鼠用于PDX模型的成瘤实验 质中，移植后20 d小鼠出生，共计生仔 39 只。以苯
收集临床新鲜剩余手术肿瘤组织，尽快移至动 酚/氯仿法抽提鼠尾 DNA，以目标外显子上下游引

物房生物安全柜内，取部分肿瘤组织分别置于70% 物 mPrkdc⁃tF/mPrkdc⁃tR 及 mIl2rg⁃tF/mIl2rg⁃tR 鉴定
RPMI1640培养基、20%胎牛血清和10% DMSO组成 F0 代小鼠。琼脂糖凝胶电泳，野生型小鼠 Prkdc 及
的保存溶液中液氮冻存及福尔巴林溶液中待用；另 Il2rg扩张条带大分别为376 bp及359 bp。F0代首建
取部分肿瘤组织用RPMI1640培养基清洗，2 h内去除 小鼠性成熟后与 NOD 野生型小鼠交配，获得 F1
坏死组织后，将肿瘤组织切成若干2 mm×2 mm×2 mm 代杂合子小鼠，再通过杂合子小鼠自交获得可稳
小块；NYG小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液，麻醉 定遗传的 F2 代 Prkdc 及 Il2rg 敲除 NYG 纯合子小
剂量为60 mg/kg，备皮消毒，开（6 ± 2）mm切口，背部 鼠模型。具体的鉴定策略及电泳结果见图 1，测
皮下移植接种，缝合后在屏障内饲养。饲养荷瘤小 序结果显示 Prkdc 缺失 10 个碱基，Il2rg 缺失 50 个
鼠2~3个月，每周观察小鼠皮下移植瘤的生长情况， 碱基。
首次生长的肿瘤为F0 代。待移植瘤长径增长至1~ 2.2 FCM检测NYG小鼠的外周血免疫细胞
2 cm，麻醉脱臼处死小鼠，剥离肿瘤组织，液氮冷 与野生型 BALB/C 小鼠相比，NYG 小鼠 CD3、

A B I12rg Prkdc
mPrkdc mPrkdc⁃tF M 1 2 G M 1 2 G
2 000 bp
E36 E37 E38 1 000 bp
750 bp
mPrkdc⁃tR 500 bp
250 bp
mI12rg mI12rg⁃tF
100 bp
E2 E3 E4
mI12rg⁃tR
A：NYG小鼠的鉴定策略；B：NYG小鼠PCR鉴定电泳结果，1、2为NYG样品，G为野生型B6小鼠基因组DNA，M为DL2000 marker。
图1 PCR鉴定NYG小鼠
Figure 1 PCR identification result of NYG mice

CD19 和 NKp46 的相对应区域没有荧光，说明 NYG 长状态见图 3。结果显示，手术 2 周后，肿瘤组织生
小鼠外周血中表达CD3、CD19和NKp46的成熟T、B 长出现增快的趋势，NYG⁃PDX成瘤正常。
和NK细胞不存在，见图2。 2.4 患者原发肿瘤和PDX肿瘤的组织学比较

2.3 人源化异种移植PDX模型原代肿瘤成瘤结果 用 NYG 小鼠构建的 PDX 模型肿瘤组织病理特
NYG 小鼠皮下种植原代肿瘤组织后，饮食、活 征与手术患者的组织病理特征类似。HE 染色结果
动及生长均良好，体重未出现明显下降。肿瘤种植 示，癌组织浸润性生长。4 例患者原发肿瘤和 PDX
2 周后，测量移植手术组织的 PDX 肿瘤体积。部分 肿瘤形态相似（图 4），PDX 肿瘤保留了原发肿瘤的
PDX 模型体积的变化趋势和小鼠移植后肿瘤的生 形态学特点。