Page 72 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第8期
               ·1114 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年8月


              UATT⁃3′；siRNA#3F，5′⁃GAAUGUGUUAAUGAUGA⁃            胞爬片的 24 孔板中过夜。第 2 天，将 EdU 溶液
              GAACTT ⁃ 3′ ；R，5′ ⁃ GUUCUCAUCAUUAACACAU⁃          （50 μmol/L）加入 24 孔板并等待 2 h，接下来按照制
              UCTT⁃3′。                                          造商提供的方案获取目的样品，最后使用荧光正置
              1.2.1  组织标本                                       显微镜拍摄图片。
                  本研究获得了本院医学伦理委员的批准（宁妇                          1.2.5 Transwell实验
              伦字〔2019〕KY⁃046 号），在获得知情同意的情况下                          使用预涂基质胶的 Transwell 小室检测细胞的
              获得胎盘组织样品。收集了 2020 年 9—12 月 40 例                   侵袭能力。将转染的细胞悬浮在 200 μL 无血清培
              产妇的胎盘组织，其中包括 20 例重度子痫前期患                          养基中（1×10 个/孔），移液到上部腔室，并将700 μL
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              者，20 例健康妊娠对照（足月妊娠）。根据美国妇产                         补充了 10%FBS 的培养基添加到下部腔室中。在
              科医师学会（ACOG）的定义，先前血压正常的妇女妊                         37 ℃下培养72 h后，将穿过微孔膜并黏附至下膜表
                                                      ［14］
              娠20周后，符合以下任何标准即可诊断为PE                      ：①     面的细胞用 4%多聚甲醛固定并用 0.1%结晶紫染
              收缩压≥140 mmHg 或舒张压≥90 mmHg；②蛋白尿                    色。通过倒置显微镜获取图片对细胞进行计数。使
              ≥0.3 g/24 h或蛋白质/肌酐比率≥0.3，或蛋白尿≥1+；                 用未预涂基质胶的Transwell小室检测细胞的迁移能
              ③具有其他相关的严重临床症状。胎盘样本取自                             力，37 ℃下培养24 h后取出小室，其余方法同上。
              靠近母体一侧胎盘 1/3 以下的代表性组织块，保存                         1.2.6 伤口愈合实验
              在-80 ℃的冰箱中备用。                                          将 1.0 × 10 个/孔细胞铺于 6 孔板中进行转染。
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              1.2.2 RNA提取、RNase R处理及qRT⁃PCR                     待细胞汇合度达95%以上用无菌200 μL枪头在细胞
                  通过TRIzol试剂从胎盘组织或细胞中分离出总                       单层上划一道划痕。分别于0 h和16 h用倒置显微镜
              RNA，与 3 U/mg RNase R 在 37 ℃下孵育 20 min，逆           拍摄（×100），Image J软件用于检测细胞迁移率。
              转 录 后 进 行 qRT ⁃ PCR 反 应 。 PCR 引 物 如 下 ：           1.2.7 蛋白免疫印迹法（Western blot）
              hsa_circ_0005579（发散型引物）正向，5′⁃TTGCCAA⁃                  使用RIPA裂解液从转染后72 h 的细胞中提取
              CAAGATGCGAGTG ⁃ 3′ ，反 向 ，5′ ⁃ AGCAGTTGGT⁃         总蛋白，加入蛋白酶抑制剂，随后用 BCA 蛋白定量
              CATCAGTCC⁃3′；Linear mRNA 引物（收敛型引物）                试剂盒测定实验样本蛋白浓度，接下来，通过十二
              正向，5′⁃CTGTGGAATGCCCTCCTGTT⁃3′，反向，5′⁃              烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl
              ACAGCACTTTCCAGGTGTCC⁃3′；GADPH 正向，5′⁃              sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS ⁃
              AGAAGGCTGGGGCTCATTTG⁃3′，反向，5′⁃GCAGGA⁃             PAGE）分离蛋白质样品并转印到硝酸纤维素膜上，用
              GGCATTGCTGATGAT⁃3′；U6正向，5′⁃CTCGCTTCG⁃             5%的脱脂奶粉溶液常温封闭 1 h，随后膜与基质金
              GCAGCACA⁃3′，反向，5′⁃AACGCTTCACGAATTT⁃               属 蛋 白 酶 2（MMP2，1∶1 000）、基质金属蛋白酶 9
              GCGT⁃3′。通过 Sanger 测序检测在胎盘和 HTR⁃8/                 （MMP9，1∶1 000）、β⁃actin（1∶1 000）抗体4 ℃摇床孵
              sVneo 细 胞 中 扩 增 的 circRNA 的 PCR 产 物 。             育过夜，回收一抗，TBST清洗2次，加入按比例稀释
              hsa_circ_0005579 的表达以 GAPDH 为内参，使用                的二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，最后使用ECL显影
               -ΔΔCt 法计算其相对表达量。                                 液进行曝光，采集图像，Image J 软件分析灰度值。
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              1.2.3 CCK⁃8法检测细胞增殖活力和克隆形成实验                       1.3 统计学方法
                  将转染的细胞接种在 96 孔板中（3×10 个/孔），                        通过SPSS 26.0软件进行统计分析，所有数据均
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              接种后分别于0、24、48、72 h，将10 μL CCK⁃8试剂添                表示为平均值±标准差（x ± s），两组间数据比较用 t
              加至每个孔中，并在37 ℃下孵育1.5 h，使用酶标仪在                      检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
              450 nm处测量每个孔的吸光度；对于克隆形成试验，
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              将处理过的细胞重新接种到6孔板中（3 000个/孔），
              12 d 后出现肉眼可见的克隆后终止培养，细胞用                          2.1 hsa_circ_0005579在PE患者胎盘中的表达水平
              PBS清洗后用2 mL甲醇固定15 min，然后用0.1%结                         PE患者及完全正常产妇临床特征见表1。与正
              晶紫染色20 min，显微镜下测定克隆数。                             常产妇组比，PE患者的收缩压、舒张压显著升高，而
              1.2.4 EdU实验                                       胎儿出生体重显著降低，有显著的PE特征。两者的
                  EdU 分析试剂盒用于检测 DNA 合成和细胞增                      产妇年龄及体重指数无明显差异，即排除其他因素
              殖。将 1×10 个处理过的细胞接种在已放置好细                          的影响。
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