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第42卷第9期 朱写译，黄金路，李欣燕. 生长分化因子15对福尔马林诱导双相疼痛的镇痛作用及机制的初步探究［J］.
2022年9月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（09）：1209-1215 ·1211 ·

鼠放置于透明有机玻璃制成的观察笼中30 min以上 1.2.3 组织免疫荧光
以适应环境。实验组鞘内注射GDF⁃15溶液（50 ng， 小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，用
由生理盐水配制，体积为5 μL），溶剂对照组则鞘内 20 mL 生理盐水和 20 mL 4%的多聚甲醛进行灌注。
注射生理盐水5 μL。小鼠鞘内注射具体方法为：小 灌注结束后取出脊髓置于生理盐水中，剥离脊髓外
鼠仰卧位固定，覆盖其头部待其冷静，左手食指与 膜，将脊髓腰膨大部分置于4%多聚甲醛中过夜，不
拇指定位小鼠髂骨处，右手食指沿脊柱寻找到髂骨 同浓度蔗糖溶液依次进行脱水，脱水完成后使用
中线处的 L5、L6 椎节间隙并标记，将注射器针头沿 OTC 进行包埋，并用 Leica 恒温冰冻切片机切片，附
60°夹角插入标记处，当感觉到阻力时，将角度调整 于多聚赖氨酸处理的载玻片上。用含 0.5% Triton⁃
为 30°夹角，并将针尖插入 L5、L6 椎间隙中，如小鼠 X100和5% BSA的PBS室温封闭60 min，一抗4 ℃孵

出现甩尾或后肢抽动表示操作成功，缓慢将GDF⁃15 育过夜，一抗包括 GFRAL 抗体（1∶50）、Iba⁃1 抗体
溶液或生理盐水注入蛛网膜下腔，控制注射时间为 （1∶100）、GFAP 抗体（1∶100）以及 NeuN 抗体（1∶
10~30 s，不可速度过快，注射完成后轻轻旋转针头 100），PBS 漂洗 3 次，用相应二抗室温孵育 60 min，
拔出，观察小鼠是否恢复正常运动功能，恢复后即 PBS漂洗4次，并用含DAPI 的抗荧光淬灭封片剂封
可进行后续实验。 片。Leica激光共聚焦显微镜SP8 型进行观察。

给药后立即在小鼠左足部皮下注射浓度为 5% 1.2.4 RT⁃PCR
的福尔马林溶液（由0.9%生理盐水配制，现配现用） 鞘内给药即中枢给予 GDF⁃15 进行福尔马林双
10 μL，注射后将小鼠放回观察笼内。分别记录小 相疼痛实验后，处死小鼠，取出脊髓组织，用 TRIzol
鼠在注射福尔马林后 0~5 min（Ⅰ相急性疼痛期）和 提取所取组织中的总 RNA，按 cDNA 逆转录试剂盒
20~40 min（Ⅱ相炎性疼痛期）内疼痛反应（舔足/咬 的步骤与程序制备 cDNA，根据 qPCR SYBR Green
足）总时长。 Master Mix 两 步 法 反 应 体 系 对 cDNA 进 行 扩 增。
GDF⁃15腹腔注射给药：32只KM小鼠分4组，每 内参为β⁃actin，用2 -ΔΔCt 法计算RNA表达量。白细胞
组8只，分别为溶剂对照组和3个不同剂量GDF⁃15实 介素（interleukin，IL）⁃6、IL⁃1β、前脑啡肽（proenkeph⁃
验组。实验前将小鼠放置于透明有机玻璃制成的观 alin，PENK）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，
察笼中30 min以上以适应环境，给药方式为腹腔注射 TNF）⁃α、强啡肽原（prodynorphin，PDYN）、β⁃actin
GDF⁃15 溶液，分为高剂量组（100 μg/kg）、中剂量组 引物序列如表1。
（30 μg/kg）和低剂量组（10 μg/kg），均由生理盐水配 表1
制，溶剂对照组腹腔注射生理盐水10 mL/kg。给药后 RT⁃PCR引物序列
Table 1 RT⁃PCR primer sequences
30 min在鼠左足部皮下注射浓度为5%的福尔马林溶
基因 引物 序列（5′→3′）
液（由0.9%生理盐水配制，现配现用）10 μL，分别记
IL⁃6 上游 TACCACTTCACAAGTCGGAGGC
录小鼠在注射福尔马林后 0~5 min（Ⅰ相急性疼痛 下游 CTGCAAGTGCATCATCGTTGTTC
期）和 20~40 min（Ⅱ相炎性疼痛期）内疼痛反应（舔 IL⁃1 上游 TGGACCTTCCAGGATGAGGACA
足/咬足）总时长。 下游 GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG
1.2.2 蛋白免疫印迹 PENK 上游 TGCAGCCAGGACTGCGCTAAAT
取小鼠大脑、小脑以及脊髓组织，RIPA 组织裂 下游 GATCCTTGCAGGTCTCCCAGAT
解液（已含 10%的蛋白酶抑制剂 PMSF）提取总蛋 TNF⁃α 上游 AGGCGGTGCTTGTTCCTCAG
下游 GGCTACAGGCTTGTCACTCG
白，BCA 法测定总蛋白浓度，加入 5×SDS 上样缓冲
PDYN 上游 CTGTGTGCAGTGAGGATTCAGG
液后，100 ℃条件下蛋白变性，-20 ℃保存。取等量 下游 GAGACCGTCAGGGTGAGAAAAG
蛋白进行 SDS⁃PAGE 凝胶电泳，冰上转膜，5%脱脂
β⁃actin 上游 AACAGTCCGCCTAGAAGCAC
奶粉封闭，4 ℃一抗孵育过夜，一抗包括 GAPDH 抗 下游 CGTTGACATCCGTAAAGACC
体（1∶20 000）以及 GFRAL 抗体（1∶1 000），TBST 漂
洗4次，每次10 min，室温相应二抗孵育1 h，TBST漂 1.3 统计学方法
洗 4 次，每次 10 min。用 Image J 软件对蛋白条带进 使用 GraphPad Prism 7.0 软件进行数据处理与
行扫描分析，以 GAPDH 条带（36 kDa）为内参，比较 统计分析，数据以均值±标准误 （x ± sx ） 表示。两组之
目的蛋白条带（45 kDa）的表达水平。 间的比较采用非配对 t 检验，多组之间的比较采用