Page 30 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第9期
               ·1224 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年9月


                  胶质瘤是成人最常见且恶性程度较高的原发                           SPIO⁃PLA 置于超滤管中，用 MES 缓冲溶液（pH=
              性脑肿瘤    ［1-2］ 。胶质瘤很少被治愈，低级别胶质瘤的                   5.51）洗涤 2 次，稀释至 2 mL，分别加入 0.3 mg EDC
              中位生存期为11.6年，而高级别胶质瘤患者的中位                          和0.6 mg NHS活化，超滤2次，加入260 μg的P53抗
              生存期不足3年       ［3-6］ 。超顺磁性氧化铁纳米颗粒（su⁃              体，混合、搅拌过夜。将所得样品超滤4次。最后测
              perparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIO）是一  试铁浓度，将其稀释至1 mg/mL。
              种具有良好生物相容性的纳米粒子，作为磁共振成                            1.2.3 纳米探针的物理性质检测
              像（magnetic resonance image，MRI）阴性对比剂在实                 透射电镜扫描SPIO⁃PLA⁃P53分子探针：取2 μL
              验研究中具有重要地位            ［7- 8］ 。而具有靶向性能的            混合均匀的 SPIO⁃PLA⁃P53 溶液滴于 300 目的铜网
              MRI 分子探针，因其可以反映体内特定生物分子的                          上，自然干燥 30 min，除去多余液体，置于透射电镜
              特征，评价组织的微结构变化，对于实现疾病的定                            下观察纳米粒子的大小及形态。
                                 ［9］
              性诊断具有重要意义 。                                            分子探针的动态散射及 Zeta 电势测定：分别用
                  P53基因参与调解细胞周期和细胞凋亡，其突变                        超声波清洗剂将1% SPIO⁃PLA及1% SPIO⁃PLA⁃P53
              产物P53蛋白高表达可促进细胞癌变，并加快癌细胞                          溶液分散均匀，过滤后加入石英比色皿中，在波长
              的生长发育，加重恶变程度 。多项研究表明脑胶质                           633 nm 的He/Ne激光下对样品进行测定。
                                     ［10］
              瘤细胞存在P53蛋白的过表达，是脑胶质瘤的关键生                          1.2.4 细胞培养及荷瘤大鼠模型构建
              物标志物    ［11-12］ 。本研究设计了P53标记的靶向超顺磁                     C6 胶质瘤细胞在 RPMI 1640 培养基、37 ℃、5%
              性氧化铁纳米颗粒SPIO⁃PLA⁃P53，用于脑胶质瘤的                      CO2恒温培养箱内进行培养。选取9只Wistar雄性大
              特异性MRI，为脑胶质瘤的诊断提供新思路。                             鼠（6~8周，体重200~250 g），本研究获得淮安市第一
                                                                人民医院研究伦理委员会批准（编号：DW⁃P⁃2021⁃
              1  材料和方法
                                                                014⁃01）。大鼠术前禁食12 h，不禁水，备皮，麻醉，消
              1.1  材料                                           毒，铺巾。俯卧位将大鼠固定于立体定仪内，以两侧
                  C6大鼠脑胶质瘤细胞株（长沙丰晖生物科技有                         内眦连线中点为起点，切开头皮，于前囟中点前l mm，
              限公司），SPIO（中科雷鸣北京科技有限公司），聚乳                        中线右旁开3 mm，用圆头牙科钻孔，有落空感时立
              酸⁃聚乙二醇⁃羧酸（PLA⁃PEG⁃COOH）（西安瑞禧生                     刻停止，用微量注射器抽取 10 μL 单细胞悬液（1×
                                                                  6
              物科技有限公司），氯仿、2⁃（N⁃吗啡啉）乙磺酸［2 ⁃                      10 个/mL），沿骨孔缓慢垂直进针，约至硬脑膜下6 mm
             （n⁃morphorphine）ethanesulfonic acid，MES］、1⁃（3⁃二    处停止，停针约 5 min（扩容），再退回 1 mm，随后缓
              甲氨基丙基）⁃3⁃乙基碳二亚胺盐酸盐［1 ⁃（3⁃dimeth⁃                  慢均匀注射10 min（1 μL/min），注射完毕停留5 min，
              ylaminopropyl）⁃ 3 ⁃ ethylcarbodiimide hydrochloride，  结束后缓慢拔针，用EC胶封住骨孔，缝合消毒。
              EDC］（西格玛奥德里奇上海贸易有限公司），N⁃羟基                        1.2.5 细胞毒性实验
              琥珀酰亚胺（N⁃hydroxysuccinimide，NHS，西格玛奥                    用 CCK⁃8 法检测 C6 细胞活力。将 C6 细胞以
                                                                     4
              德里奇上海贸易有限公司），P53（1C12）Mouse mAb                   2×10 个/孔接种于 96 孔板上。分成 3 组，第 1 组不
             （上海超研生物科技有限公司）。                                    做任何处理，第 2 组用 200 μg/mL 的 SPIO⁃PLA 纳
              1.2  方法                                           米探针溶液替换培养基，第 3 组用 200 μg/mL 的
              1.2.1 C6细胞表面P53抗原检测                               SPIO⁃PLA⁃P53纳米探针溶液替换培养基，将上述3组
                  采用流式细胞仪检测细胞表面及内部P53蛋白                         细胞于培养箱中孵育 48 h 后加入培养基及 10 μL
              的表达情况。                                            CCK⁃8液继续培养2 h，然后用酶标仪测量光密度值
              1.2.2 靶向分子探针的合成                                   并记录细胞活性。

                  SPIO⁃PLA 分子探针的合成：向装有 30 g PLA⁃                1.2.6 分子探针检测体外血脑屏障通透性
              PEG⁃COOH粉末的离心管中加入1 mL氯仿，超声波                            常规培养鼠脑微血管内皮细胞株（RCMEC），随

              溶解，随后加入10 mg 的SPIO溶液混匀，注入10 mL                    机分为 3 组，1 组为对照组，另外 2 组作为实验组。
              水乳化搅拌过夜。待有机溶剂挥发完全后，洗涤                             实验组分别在培养皿中加入 200 μg/mL 的 SPIO⁃
              PLA⁃PEG⁃COOH 4 次，将样品 4 ℃保存备用。计算                   PLA及SPIO⁃PLA⁃P53纳米探针溶液，对照组不作特
              所得样品的铁浓度。                                         殊处理，孵育48 h。随后制备单细胞悬液并置于EP
                  SPIO⁃PLA⁃P53 分子探针的合成：取 2 mg 的                 管中并进行MRI T2WI成像。采用7.0 T小动物专用
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