Page 34 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第1期
· 28 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年1月

decreased. The contents of IL⁃1 mRNA，IL⁃6 mRNA and TNF⁃α mRNA in colon tissue were significantly decreased. The pathological
changes of colon tissue were significantly improved. 16S rRNA sequencing showed that the relative abundance of species increased
significantly，the α diversity and the composition of intestinal microflora changed significantly in the A. muciniphila treatment group. In
the A. muciniphila treatment group，the abundance of multiple probiotics increased. Conclusion：Probiotics A. muciniphila can relieve
diarrhea caused by ETEC through increasing intestinal flora diversity，protecting colonic mucosa and reducing the expression of
inflammatory factors.
［Key words］ ETEC；Akkermansia muciniphila；diarrhea；gut microbiota
［J Nanjing Med Univ，2023，43（01）：027⁃033］

产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia 美国）培养，3.7 g/100 mL，高压蒸汽灭绝法灭菌后，
coli，ETEC）是引起腹泻的主要致病菌之一 ，严重 冷却至55 ℃时向培养基中加入终浓度为6 g/L的苏
［1］
威胁人体健康。目前临床所用的药物治疗效果不 氨酸，37 ℃时加入 A. muciniphila，使用厌氧箱进行
佳且不良反应多。益生菌具有调节肠道菌群、减轻 培养 48 h；ETEC 使用 LB 培养基，于 37 ℃恒温摇床
炎症反应等功能，可以缓解ETEC导致的腹泻情况； 中进行培养12 h。
但是不同益生菌治疗ETEC所致腹泻的具体机制并 1.2.2 腹泻模型的构建
不清楚。 小鼠适应性饲养1周后，通过ETEC的灌胃构建
嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila， 腹泻模型小鼠。培养ETEC 至吸光度为1.0，菌量约
A. muciniphila）与宿主健康有着密切联系，多项研究 为 1×10 CFU/mL，直接灌胃小鼠。造模约12 h后观
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表明，A. muciniphila 可以改善炎症反应和代谢综合 察小鼠，造模成功的判断标准为小鼠出现腹泻、无
［3］
征的不良症状 ，延缓代谢性疾病的发展进程 。 力、厌食等症状。
［2］
因此，它也被认为是对宿主机体有益的潜在益生 1.2.3 A. muciniphila对腹泻模型小鼠的影响
［4］
菌 。目前尚无关于 A. muciniphila 减缓 ETEC 致小 将15只小鼠随机分为3组，每组均为5只。PBS
鼠腹泻的具体研究。本研究采用灌胃方式给予小 组，每天正常饮食；模型组，小鼠提前空腹 6 h，之
鼠A. muciniphila菌液连续5 d，之后同样采取灌胃的 后灌胃 ETEC 菌液，并在接下来 24 h 内观察小鼠腹
方式给予ETEC菌液感染小鼠，观察小鼠腹泻情况， 泻情况、精神状况；干预组，培养 A. muciniphila 至
感染 ETEC 后 24 h 小鼠体内炎症因子的表达、肠道 600 nm下吸光度约为1.0，菌量约为 1×10 CFU/mL。
9
损伤情况和肠道菌群改变情况，探讨 A. muciniphila 取菌液0.2 mL进行灌胃，连续灌胃5 d。之后小鼠空
减轻ETEC致小鼠腹泻的机制，为预防和减缓ETEC 腹 6 h，灌胃 ETEC 菌液，接下来 24 h 观察小鼠腹泻
引起的腹泻提供新的治疗方案。 情况、精神状况。造模结束后使用代谢笼收集各组
小鼠粪便，颈椎脱臼处死小鼠收集结肠组织和血
1 材料和方法
液。血液 2 800 r/min 离心 15 min，收集血清和部分
1.1 材料 结肠组织置于-80 ℃冰箱冻存。
菌株 A. muciniphila 和 ETEC 均来自中国工业微 1.2.4 腹泻程度观察
生物保藏中心（CICC）。4~6 周龄 SPF 级 C57BL/6 雄 小鼠腹泻程度的计算公式为：稀便率=一定时
性小鼠 24 只（北京斯贝福生物有限公司）。小鼠喂 间内所排稀便数/一定时间内排便总数；腹泻指数=
养在动物房，12 h 光照/12 h 黑暗循环，温度控制在 稀便率×稀便级 。
［5］
23 ℃，湿度控制在53%。本研究经东部战区疾病预 1.2.5 ELISA检测小鼠炎症因子
防 中 心 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 审 批（审 批 号 取小鼠血清，按 ELISA 试剂盒（RD 公司，美国）
2022015642），符合实验室动物管理与使用准则。 说明书检测，使用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度，
1.2 方法 根据相应标准曲线计算白细胞介素（interleukin，
1.2.1 A. muciniphila及ETEC的培养 IL）⁃1β、肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α，
A. muciniphila 使用脑心浸液培养基（BD 公司， TNF⁃α）、IL⁃6的含量。