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第43卷第1期            孙学伟，何君花，姜新泽，等. 益生菌A. muciniphila 改善大肠杆菌诱导的小鼠腹泻［J］.
                2023年1月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（01）：027-033                         · 29  ·


                1.2.6  qRT⁃PCR检测小鼠结肠组织mRNA的表达                     应程序为94 ℃初始变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃
                    将冻存在-80 ℃冰箱的小鼠结肠组织取出，使                        退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，26 个循环；72 ℃ 5 min。
                用 RNA 提取试剂盒（上海飞捷公司）从结肠组织中                         扩增产物使用磁珠纯化，纯化后的 PCR 产物进行
                提取总 RNA。各检测指标的引物序列如下（表 1）。                        Illumina PE250 文库构建及测序。以上测序由上海
                使 用 PowerUp SYBR Green 试 剂 盒 ，反 应 体 系 为           欧易生物科技有限公司完成。
                2 × SYBRGreenMasterMix10μL、ForwardPrimer2μL、      1.3  统计学方法
                Reverse Primer 2 μL、Template 2 μL、ddH2O 6 μL，用        采用 Prism 5.0 软件进行统计学分析。计量资
                荧光定量PCR仪进行扩增。以β⁃actin为内参，计算                       料用均数±标准差（x ± s）表示。使用单因素方差分
                各mRNA相对表达水平。                                      析，用Newman⁃Keuls比较总差异，P < 0.05为差异有
                                                                  统计学意义。
                              表1 引物序列及名称
                        Table 1 Primer sequences and names
                                                                  2 结    果
                    引物名称                  序列（5′→3′）
                 TNF⁃α正向引物        ACGTCGTAGCAAACCACCAA            2.1  ETEC感染后小鼠的表现
                 TNF⁃α反向引物        TAGCAAATCGGCTGACGGTG                PBS组存活率为100%，而模型组24 h存活率明
                 IL⁃6正向引物         TGATGCACTTGCAGAAAACA            显下降，仅为 40%；干预组 24 h 存活率是 75%，与模
                 IL⁃6反向引物         ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC         型组相比，存活率明显增加。感染 ETEC 后小鼠表
                 IL⁃1正向引物         ATGAAAGACGGCACACCCAC
                                                                  现出身体蜷缩成团、毛发光泽度降低、精神不振、行
                 IL⁃1反向引物         GCTTGTGCTCTGCTTGTGAG
                                                                  动迟缓、进食饮水频率降低、大便稀疏、腹泻情况增
                1.2.7  结肠组织病理切片观察小鼠结肠组织的变                         加等症状。干预组小鼠腹泻率及腹泻指数较模型
                化                                                 组小鼠明显降低（表2）。
                    造模结束后，将结肠取出并用 PBS 冲洗掉结肠                                 表2 各组小鼠的腹泻及存活情况
                组织中的血液。之后使用4%多聚甲醛固定结肠组                            Table 2  Diarrhea rate and survival rate of mice in each
                织，经脱水、石蜡包埋、切片（4~5 μm）、二甲苯脱蜡、                              group
                无水乙醇水合、HE染色固定，镜下观察结肠组织形                              指标       PBS组（n=5）   模型组（n=5） 干预组（n=5）
                态变化。                                               腹泻率（%）         0           100         34
                                                                   腹泻指数           0           50          33
                1.2.8  16S rRNA检测小鼠肠道菌群的变化
                                                                   存活率（%）        100          40          75
                    将小鼠粪便从-80 ℃冰箱取出，用粪便DNA提取
                试剂盒（QIAamp公司，德国）提取小鼠粪便DNA，将粪                      2.2  血清炎症因子水平的变化
                便DNA标本进行16S rRNA基因V3~V4（341F~806R）                    各组小鼠血清炎症因子水平的检测结果显
                区域的 PCR 扩增。反应体系包含 2 × PCR Buffer                  示，与PBS组相比，模型组小鼠血清炎症因子IL⁃1β、
                15 μL、上游引物 1 μL（5 pmol/L）、下游引物 1 μL               IL⁃6和TNF⁃α浓度明显升高，干预组较模型组IL⁃1β、
               （5 pmol/L）、模板 DNA ≥1 μL（50 ng）、DNA Polymerase      IL⁃6 和 TNF⁃α浓度明显降低，差异具有统计学意义
                0.6 μL（1.25 U/μL）、ddH2O补足至30 μL。PCR的反            （P < 0.05，图1）。

                                      ***                            ***                            *
                               ***                            ***                            *
                      50                            150                            400
                     （ pg/mL）  40                  （ pg/mL）  100                  （ pg/mL）  300

                      30
                                                                                   200
                     IL⁃1β  20                     IL⁃6  50                       TNF⁃α  100
                      10
                       0                              0                              0
                          PBS组   模型组    干预组              PBS组   模型组    干预组              PBS组   模型组    干预组
                                                   两组比较，P < 0.05， P < 0.001，n=5。
                                                                 ***
                                                          *
                                              图1   各组小鼠血清IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α水平
                                   Figure 1 Levels of IL⁃Iβ，IL⁃6 and TNF⁃α in serum of mice in each group
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