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第43卷第10期 邵宇云，王 涵，王 潇，等. Notch1在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤中的作用及机制［J］.
2023年10月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1350-1355，1365 ·1351 ·
and promotes the RIPK1⁃MLKL necroptosis pathway，aggravating the liver injury.
［Key words］ acetyl⁃para⁃aminophenol；liver injury；myeloid⁃specific knockout；Notch1；TAK1；necroptosis
［J Nanjing Med Univ，2023，43（10）：1350⁃1355，1365］
药物性肝损伤（drug⁃induced liver injury，DILI）
1 材料和方法
是临床上最常见的肝脏疾病，由某种特定的药物或/
和其代谢产物直接或间接作用于肝脏导致，其临床 1.1 材料
［1］
表现多样 。一项来自308个医学中心25 927例患 SPF级雄性C57BL/6J背景的髓系特异性Notch1
［2］
者的回顾性研究显示，DILI 发生率为 0.023 8% 。 敲除（Notch1 M ⁃ KO ）和对照 floxed Notch1（Notch1 FL/FL ）
对乙酰氨基酚（acetyl⁃para⁃aminophenol，APAP）是临 小鼠，6~8 周龄，来自美国 Jackson 实验室。ELISA
床上最常用的解热镇痛药物，过量的 APAP 摄入是 试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司），APAP（Sigma⁃
导致严重肝损伤最常见的病因 。然而 APAP 导致 Aldrich 公司，美国）。Notch1 抗体、TAK1 抗体、p65
［3］
DILI的发病机制还有待进一步研究。 抗体、p⁃p65抗体、Casp⁃8抗体、RIPK1抗体、p⁃MLKL
在APAP诱导的肝损伤（APAPinducedliver injury， 抗体（CST 公司，美国），p⁃TAK1 抗体（赛默飞公司，
AILI）中，肝脏固有免疫反应激活和肝细胞死亡是其 美国），荧光标记二抗（Jackson Immunoresearch，美
发病机制中的重要环节。既往研究显示，转化生长因 国），CD11b 抗体（Abcam 公司，美国），H2DCFDA 活
子β激活激酶1（transforming growth factor⁃β⁃activated 性氧荧光探针（ThermoFisher 公司，美国）。荧光显
kinase 1，TAK1）是核转录因子（nuclear factor，NF）⁃κB 微镜（Keyence 公司，日本），全自动生化分析仪
（p⁃65）信号通路激活过程中的关键激酶，在机体固 （Olympus公司，日本）。
有免疫和适应性免疫中发挥重要作用，如在巨噬细 1.2 方法
胞中，TAK1可调控gasdermin D（GSDMD）的水解，从 1.2.1 小鼠肝细胞和肝巨噬细胞分离
［4］
而调控细胞死亡 。而在巨噬细胞中，caspase⁃8 小鼠饲养于南京医科大学实验动物中心，温度
（Casp⁃8）已被证明是 NLRP3 炎症小体形成、耶尔 （25±1）°C，湿度（55±5）%，光照时间维持 12 h 光照
森菌诱导的促炎细胞因子表达及焦亡过程中必需 和12 h 黑暗周期，并给予充足的食物和无菌蒸馏水
的 。进一步研究显示，抑制 Casp⁃8 的表达或敲除 供其自由采食，所有实验动物符合南京医科大学实
［5］
Casp⁃8 后，受体相互作用蛋白激酶 1（receptor⁃inter⁃ 验动物福利伦理（批准编号：IACUC⁃2206039）。
acting protein kinase 1，RIPK1）⁃RIPK3 ⁃ 混合谱系激 采用“两步灌注法”分离 Notch1 M⁃KO 和 Notch1 FL/FL
酶域样蛋白（mixed lineage kinase domain⁃like protein， 小鼠的原代肝细胞及肝脏巨噬细胞 ［10］ 。每组取 3 只
MLKL）途径被激活，诱导肿瘤坏死因子（tumor necro⁃ 小鼠，打开小鼠腹腔，暴露门静脉，门静脉穿刺成功
sis factor，TNF）释放，加剧细胞损伤，甚至死亡 ［6-8］ ； 后固定，10 mL/min 流量经过门静脉灌注含 1%双抗
说明 Casp⁃8 可能是控制细胞死亡并防止组织损伤 的 EGTA 溶液（9.5 mg EGTA 粉末加至 50 mL HBSS
的关键。在AILI中，肝巨噬细胞（如Kupffer细胞）通 中，37 ℃预热30 min），总量为40 mL，再用含1%双抗
过释放大量的促炎因子介导炎症反应，从而加重肝 的Ⅱ型胶原酶（0.01 g 胶原酶加至 40 mL GBSS 溶液
［1］
细胞死亡，参与肝损伤的进展 。本课题组既往研 中，37 ℃预热30 min）灌注肝脏，灌注完成后可见肝
究发现阻断巨噬细胞 Notch1 信号可以加重 AILI ； 脏呈土黄色。灌注完毕后用组织剪将肝脏从腹腔
［9］
但Notch1信号调控APAP诱导肝细胞死亡的机制仍 分离后置入含有胶原酶维持液的培养皿中，用镊子
不清楚，有待进一步研究。 钝性分离肝脏直至无明显块状组织，制成细胞悬
本研究构建腹腔注射APAP诱导小鼠肝损伤模 液。70目过滤网过滤后离心，GBSS重悬离心（50 g，
型，探索髓系特异性 Notch1 敲除（myeloid⁃specific 5 min）清洗 2 次，Percoll 密度梯度离心纯化，分别获
M ⁃ KO ）诱导肝细胞死亡的机 得原代肝细胞和肝巨噬细胞，0.4%台酚蓝测定细胞
Notch1 knockout，Notch1
制。研究发现，髓系特异性 Notch1 敲除通过上调 状态并计数，DMEM+10%胎牛血清（FBS）+1%青链
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TAK1 的表达，从而抑制 Casp⁃8，调控 RIPK1⁃MLKL 霉素培养，接种至 6 孔板中，细胞数为 1.0×10 ~1.5×
坏死性凋亡信号，加重肝组织损伤。 10 个/孔，培养箱（37 ℃、5% CO2 ）中培养3 h后，37 ℃
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