Page 26 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第10期
·1352 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年10月
预热的 PBS 清洗细胞 3 次，去除非贴壁细胞。24 h 度值。
换液，并收集上清液，-80 ℃储存。按照每 1×10 个 1.2.7 原代肝细胞ROS检测
6
细胞加入 100 μL RIPA，混匀后冰浴静置 30 min 充 分离 Notch1 FL/FL +APAP 组、Notch1 M ⁃ KO +APAP 组
分裂解细胞。BCA定量蛋白，用于Western blot检测。 小鼠（每组 4 只）原代肝细胞进行 ROS 检测，DCF 探
1.2.2 小鼠AILI模型的制备及生存率分析 针（1∶500）加入不含血清培养基的原代肝细胞，
M⁃KO FL/FL 小鼠各 6 只，腹腔注 37 ℃孵育20~30 min。在荧光显微镜下观察并采集
取 Notch1 和 Notch1
射 APAP 以构建 AILI 模型，APAP 溶液在实验使用 图像。
前1 h配制，将APAP溶解在PBS中，浓度为10 mg/mL， 1.3 统计学方法
并在水浴箱中加热到40 ℃。雄性小鼠禁食16 h，然 采用Prism8软件进行数据统计学分析，Kaplan⁃
后用 400 mg/kg APAP 腹腔注射。在注射后的 72 h Meier 法进行小鼠生存分析；计量数据采用均值±标
内每12 h观察小鼠存活情况并记录。 准差（x ± s）表示，组间比较采用 t 检验。P < 0.05 为
1.2.3 小鼠分组及处理 差异有统计学意义。
M⁃KO FL/FL 小鼠各 12 只，分别随机
Notch1 和 Notch1
2 结 果
取 6 只 ，通 过 腹 腔 注 射 APAP 构 建 AILI 模 型
（Notch1 FL/FL +APAP组、Notch1 FL/FL +APAP组），具体方法 2.1 髓系特异性Notch1敲除验证
同前。其余6只腹腔注射PBS作为对照（Notch1 FL/FL + 分别分离Notch1 FL/FL 、Notch1 M⁃KO 小鼠的原代肝细
M⁃KO +PBS 组）。24 h 后通过乙醚吸入 胞 和 肝 巨 噬 细 胞 ，提 取 蛋 白 ，Western blot 检 测
PBS 组、Notch1
对小鼠进行安乐死，收集血液和肝脏组织。 Notch1的表达。结果显示，Notch1 M⁃KO 小鼠肝巨噬细
1.2.4 肝功能及细胞因子检测 胞不表达Notch1，而Notch1 FL/FL 小鼠的原代肝细胞和
小鼠的血液样本室温静置 30 min，3 000 r/min 肝巨噬细胞中Notch1正常表达（图1A）。
离心12 min，收集上清。采用全自动生化分析仪检测 2.2 Notch1 M⁃KO 加重APAP诱导的肝损伤
丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、 APAP 腹腔注射构建小鼠 AILI 模型，观察小鼠
天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase， 死亡率。结果显示，与 Notch1 FL/FL +APAP 组相比，
AST）。TNF⁃α、白介素（interleukin，IL）⁃1β、IL⁃6、转化 Notch1 M⁃KO +APAP组小鼠死亡率有所增加，但差异无
生长因子（transforming growth factor，TGF）⁃β1 使用 统计学意义（图1B）。
ELISA检测。 HE染色结果显示，PBS处理的小鼠肝脏病理未
1.2.5 肝脏组织切片染色 见明显异常。小鼠腹腔注射 APAP 后，肝脏病理提
收集小鼠肝组织，部分肝组织石蜡包埋后切片 示肝细胞体积增大，窦道淤血，并出现广泛的坏
（5 μm）行 HE 染色观察肝脏病理情况，Suzuki 评分 死。与 Notch1 FL/FL +APAP 组相比，经 APAP 腹腔注射
评估肝组织损伤程度。部分肝组织OCT包埋后，冰 的Notch1 M⁃KO 小鼠肝窦淤血，肝细胞体积增大及空泡
冻切片（10 μm）行免疫荧光染色观察肝组织CD11b 样变性，细胞边界形态模糊等更为严重，出现广泛
和 p⁃TAK1 的表达情况；冰冻切片室温复温 30 min， 细胞的坏死和炎性细胞浸润；两组 Suzuki 评分差异
4%福尔马林固定 10 min，0.1% Triton X⁃100 破膜 有统计学意义（P < 0.001，图1C）。血清转氨酶是评
（2.5% BSA），CD11b 抗体、p⁃TAK1 抗体（1∶100）4 ℃ 价肝功能损伤的一个重要标志，PBS 处理的小鼠血
孵育过夜，荧光标记二抗（1∶250）室温避光孵育1 h， 清ALT及AST水平正常，而APAP处理组表达明显升
DAPI封片，在荧光显微镜下观察并采集图像。 高。与 Notch1 FL/FL +APAP 组相比，Notch1 M⁃KO +APAP
1.2.6 Western blot检测 组小鼠血清ALT 和AST 水平升高更明显，差异具有
50 mg 肝组织加入 RIPA 蛋白裂解液超声碾 统计学意义（P < 0.001，图1D）。进一步通过免疫荧
磨后提取总蛋白，BCA 试剂盒定量，确保蛋白上 光染色观察肝脏切片中 CD11b 的表达情况，APAP
样量为 30 μg/孔。经过电泳，转膜，封闭，Notch1 抗 处理后，肝组织切片中 CD11b 表达明显升高，说明
体、TAK1 抗体、p⁃TAK1 抗体、p65 抗体、p⁃p65 抗体、 肝损伤后肝内巨噬细胞浸润增多；而与 Notch1 FL/FL +
Casp⁃8 抗体、RIPK1 抗体、p⁃MLKL 抗体（1∶1 000） APAP 组相比，Notch1 M⁃KO +APAP 组肝脏巨噬细胞
4 ℃孵育过夜，根据一抗种属进行二抗（1∶3 000） 浸润增加更明显，差异有统计学意义（P < 0.001，
室温孵育 1 h，曝光得到条带后经 Image J 分析灰 图 1E）。
