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第43卷第10期        张芙蓉，苟黎明，李 妍，等. 利用CRISPER/Cas9技术构建肝脏特异性敲入Lcat基因小鼠［J］.
                 2023年10月                    南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1366-1371                      ·1367 ·


                    成簇规律间隔的短回文重复序列（clustered                          本研究利用 CRISPR/Cas9 的技术，通过同源
                regularly interspaced short palindromic repeats，  重组的原理设计并体外转录 gRNA，同时构建同源
                CRISPR）是一组广泛存在于细菌和古细菌中的DNA                        重组载体（donor vector）。将 Cas9、gRNA、donor vector
                序列，Cas 序列位于其附近，编码 CRISPR 相关蛋白                     同时注射到小鼠的受精卵中并获得 F0 代小鼠。
                                                ［1-2］
                9（CRISPR⁃associated protein 9，Cas9） 。CRISPER/     将测序正确的 F0 代小鼠与 C57BL/6JGpt 小鼠交配
                Cas9 技术发现细菌中存在病毒的天然基因组编辑                          得到稳定遗传的 F1 代小鼠后将其与肝脏特异性
                体系，即细菌识别特定的病毒 DNA 片段并对其进                          表达 Cre 的小鼠交配获得肝脏特异性敲入 Lcat 的
                行切割使其失活。利用这一特性，研究人员通过                             小鼠。
                设计特定的向导 RNA（guide RNA，gRNA）来识别
                                                                  1 材料和方法
                生物体基因组特定的 DNA 位点并对其进行识别
                和切割 。CRISPER/Cas9 技术因其更快更高效的                      1.1  材料
                      ［3］
                特点，已成为众多基因编辑技术中运用最广泛的                             1.1.1  实验动物
                技 术 ［4- 6］ ，特 别 是 基 因 编 辑 小 鼠 。 本 研 究 使 用             本研究所用小鼠品系为 C57BL/6，该品系源自
                CRISPER/Cas9 技术完成了基因编辑小鼠的构建 。                     Abby Lathrop 小鼠株的近交品系实验鼠，所有小鼠

                    卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（lecithin⁃cholesterol              均购自江苏集萃药康生物科技有限公司。动物实
                acyltransferase，LCAT）是一种广泛存在于血浆中的                 验符合南京医科大学伦理委员会的规定并被授
                酶 ，主要由肝脏合成并分泌，对维持机体胆固醇稳态                          权。所有实验小鼠均饲养于无特定病原体（specific
                 ［7］
                以及参与血浆中胆固醇反向转运（reverse cholesterol                pathogen free，SPF）环境中，光照时间为 6：00~18：00
                                        ［7］
                transport，RCT）起重要作用 。在胆固醇逆向转运                    （明/暗循环 12 h），温度为（22±3）℃，所有动物可自
                过程中，LCAT 将游离的胆固醇进行酯化，形成的                          由饮食与活动。
                胆固醇酯经转运蛋白转运至肝脏进行代谢，从而                             1.1.2  主要试剂
                使得外周多余的胆固醇被清除，以维持体内胆固                                 2×TaqPlusMasterMix、RNA⁃easyIsolationReagent、
                醇平衡   ［8-9］ 。大量研究表明，体内LCAT水平或活性                   HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR、2 × SYBR Green
                与众多代谢疾病密切相关            ［10］ 。LCAT 不同程度的突          MasterMix（南京诺唯赞生物科技有限公司）；蛋白酶
                变及缺失会导致家族性LCAT缺乏症和鱼眼病                    ［11-13］ ；  抑制剂、RIPA 蛋白裂解液（上海碧云天生物技术有
                此外，LCAT 水平或活性异常可导致胆固醇代谢异                          限公司）；PVDF 膜（Millipore 公司，美国）；鼠抗小鼠
                常，已被报道与心血管疾病和脂肪肝的发生发展有                            β⁃actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；兔抗小
                独立的相关性      ［14-15］ 。与此同时，本课题组之前的研                鼠 LCAT 抗体（武汉博士德生物有限公司）；ECL 超
                究也证实 LCAT 参与肝性骨病的调控，而具体机制                         敏发光液（上海天能生命科学有限公司）；肝脏特异
                需要进一步探索        ［16］ 。因此，构建肝脏特异性敲入                 性 Lcat 基因过表达小鼠的 DNA 鉴定引物序列信息
                Lcat 小鼠对 LCAT 作为胆固醇代谢异常疾病治疗靶                      及 qPCR 引物序列见表 1，所有引物合成以及测序
                点的进一步研究具有重要意义。                                    结果均来自南京擎科生物技术有限公司。

                                                 表1  小鼠DNA鉴定及qPCR引物序列
                                        Table 1  The primer sequences for mice genotyping and qPCR
                    引物名称                       上游序列（5′→3′）                            下游序列（5′→3′）
                    H11                ATGCCCACCAAAGTCATCAGTGTAG               AGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTA
                    H11⁃wt             CAGCAAAACCTGGCTGTGGATC                  ATGAGCCACCATGTGGGTGTC
                    Alb1               GGGCAGTCTGGTACTTCCAAGCT                 TAGCTACCTATGCGATCCAAACAAC
                    Actb               GGCTGTATTCCCCTCCATCG                    CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
                    Lcat               GTAACCACACACGGCCTGTC                    TCTTACGGTAGCACATCCAGTT

                1.2  方法                                           polyA基因片段定点插入到小鼠的H11位点。gRNA
                1.2.1  Lcat基因敲入小鼠模型的构建                            的序列为 5′ ⁃ CTGAGCCAACAGTGGTAGTA ⁃ 3′。将

                    利用 CRISPR/Cas9 技术，将 CAG⁃LSL⁃Lcat⁃His⁃         CRISPR/Cas9 体 系 和 donor vector 显 微 注 射 到
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