Page 42 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第10期
·1368 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年10月

C57BL/6JGpt 小鼠的受精卵中，获得 F0 代小鼠。 后对内源基因表达影响较小，因此针对 H11 位点合
经 PCR 和 测 序 验 证 正 确 的 F0 代 阳 性 小 鼠 与 成gRNA序列。采用CRISPR/Cas9技术将CAG⁃LSL⁃
C57BL/6JGpt 小鼠交配获得可稳定遗传的 F1 代阳 Lcat⁃His⁃polyA 片段基因片段定点插入到小鼠的
性小鼠模型。将 F1 代小鼠与肝脏特异性表达 Cre H11位点上。载体结构见图1。
的小鼠交配获得 F2 代小鼠并对其进行基因鉴
定。
1.2.2 小鼠基因型的鉴定 AMP
10 000
取上述 F2 代小鼠的脚趾并使用碱提法提取基
因组DNA，通过PCR 技术检测目的基因表达。PCR 2 000
反应体系为2×Taq Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上 pUCorigin
下游引物均为 0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反应条件为：
95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，35 个循 Gps000106⁃dsDNA⁃Lcat⁃S2
环；72 ℃ 5 min。对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳 10 941 bp CAG promoter
分析。
1.2.3 实 时 荧 光 定 量 PCR（quantitative real ⁃ time 8 000 4 000
PCR，qPCR）检测小鼠不同组织Lcat基因mRNA表达 His⁃Tag loxP
利用 TRIzol 法提取组织总 RNA，采用逆转录试 Rabbit⁃PolyA
loxP 3*SV40pAstip
剂盒制备 cDNA，qPCR 反应体系为 2×SYBR qPCR
Lcat⁃CDS
Master Mix 5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物均为0.2 μL，
6 000
ddH2O 3.6 μL。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，
图1 载体结构示意图
60 ℃ 30 s，40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃
Figure 1 Diagram of carrier structure
15 s。单个样品做 3 个重复，内参基因为 Actb，根
据公式 2 - ΔΔCT 计算 Lcat mRNA 在不同组织中的表 2.2 肝脏特异性敲入Lcat小鼠基因型鉴定
达水平。 将 F0 代小鼠与 C57BL/6JGpt 小鼠交配获得 F1
1.2.4 Western blot 验证小鼠不同组织 LCAT 蛋白 代小鼠，对 1 周内的 F1 代小鼠进行剪趾并提取
水平 DNA 后进行PCR，核酸电泳结果中F1代杂合子H11
颈椎脱臼法处死野生型和肝脏特异性敲入Lcat 和H11⁃wt均有条带显示（图2A）。后将F1代杂合子
的小鼠后，依次提取各组织并剪取 30 mg 放入含蛋 与 Alb⁃iCre 小鼠交配得到肝脏特异性敲入 Lcat 小
白酶抑制剂的蛋白裂解液中，研磨，12 000 r/min 离 鼠。核酸电泳结果中H11、H11⁃wt和Cre均有条带显
心 15 min 取上清，加入上样缓冲液后 100 ℃金属浴 示（图2B）。
8 min，提取总蛋白。在 120 V 电压下经 SDS⁃PAGE
A
胶分离蛋白，湿转法将蛋白转至 PVDF 膜上，使用 （bp） 1 2 3 4 5 6 7 WT
500- ←H11⁃wt
5%的脱脂奶粉室温封闭 1 h 后孵育一抗（LCAT 稀
释比为 1∶1 000，β⁃actin 稀释比为 1∶10 000），4 ℃摇 200- ←H11

床孵育过夜后用 PBST 洗 3×10 min，二抗 1∶10 000 B （bp） 1 2 3 4 5 6 WT
稀释后室温孵育 1 h，PBST 洗 3×10 min 后显影成 500- ←Cre
像，使用 Image J 对 Western blot 条带的灰度值进行
500- ←H11⁃wt
统计分析。
←H11
2 000-
2 结 果
A：对 7 只出生后第 7 天 F1 代小鼠进行剪趾提取基因组 DNA，
2.1 小鼠Lcat基因修饰靶点gRNA序列设计及表达 PCR后完成琼脂糖凝胶电泳；B：对6只出生后第7天F2代小鼠进行
载体构建 剪趾提取基因组DNA，PCR后完成琼脂糖凝胶电泳。
由于小鼠第 11 号染色体上的 H11 位点位于 图2 F1代和F2代小鼠基因型鉴定结果
Eif4enif1 与 Drg1 这两个基因之间，且外源基因插入 Figure 2 Identification of genotype in F1 and F2 mice