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第43卷第11期 王 舒，江婧月，王 迪，等. 羟氯喹介导NF⁃κB/NLRP3通路抑制M1型巨噬细胞极化缓解
2023年11月 小鼠肠道炎症［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（11）：1479-1486 ·1481 ·
表2 组织病理学评分标准 胞，上机检测，用FlowJo_V10软件分析。
Table 2 Scores for histological evaluation 1.2.7 BMDM体外诱导分化及培养
分值 描述
分离小鼠胫骨和股骨，暴露骨髓腔，吸取RPMI⁃
0 正常组织
1640 培养基冲洗骨髓至离心管中。无菌滤网过滤，
1 轻度炎症伴少量炎症细胞浸润
离心后弃上清，加入3 mL红细胞裂解液，静置5 min，
2 较多炎症细胞浸润，隐窝及上皮破坏，杯状细胞
PBS 清洗 1 次。用 RPMI⁃1640（含 10%FBS）重悬铺
黏液分泌减少
板，加入 10 ng/mL M⁃CSF，培养箱中培养，分别于铺
3 黏膜和黏膜下层较多炎症细胞浸润，伴隐窝脓
肿，上皮严重破坏 板第 3、5、7 天更换培养基，第 7 天获得成熟的骨髓
4 炎症细胞浸润黏膜全层，隐窝完全消失 来源巨噬细胞。
1.2.8 BMDM的处理及分组
醇等溶剂提取RNA并检测浓度，根据逆转录试剂盒 将BMDM 分为对照组、LPS/IFN⁃γ组、HCQ+LPS
操作说明逆转录合成cDNA。北京擎科生物科技有 /IFN⁃γ组和PDTC+LPS/INF⁃γ组。LPS/IFN⁃γ组加入
限公司进行引物合成。相关引物序列如下：GAPDH LPS（100 ng/mL）及 IFN⁃ γ（20 ng/mL）处理 24 h，
（mouse）上游：5′⁃AGGTCGGTGTGAACGGA⁃TTTG⁃ HCQ+LPS /IFN⁃γ组提前加入 HCQ（10 μmol/L）预
3′，下游：5′⁃TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA⁃3′； 处 理 2 h，PDTC+LPS/INF⁃ γ 组 提 前 加 入 PDTC
IL⁃1β（mouse）上游：5′⁃AAGGGGACATTAGGCAG⁃ （10 μmol/L）预处理 30 min，之后处理同 LPS/IFN⁃γ
CAC⁃3′，下游：5′⁃ATGAAAGA⁃CCTCAGTGCGGG⁃ 组，收集细胞进行相关实验。
3′ ；IL ⁃ 23（mouse）上 游 ：5′ ⁃ CAGCAGCTCTCTCG⁃ 1.2.9 蛋白质免疫印记实验
GAATCTC ⁃ 3′ ，下 游 ：5′ ⁃ TGGATACGGGGCACAT⁃ 蛋白上样后100 V恒压电泳。冰浴状态下250 mA
TATTTTT⁃3′；IL⁃12（mouse）上游：5′⁃CAATCACGC⁃ 恒流转 PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭 1 h，加入一抗
TACCTCCTCTTTT ⁃ 3′ ，下 游 ：5′ ⁃ CAGCAGTGCAG⁃ （1∶1 000）4 ℃过夜孵育。次日，TBST 漂洗 3 次，每
GAATAATGTTTC⁃3′；iNOS（mouse）上游：5′⁃GTTCT⁃ 次 10 min；室温下孵育二抗（1∶10 000）1 h；TBST 漂
CAGCCCAACAATACAAGA⁃3′，下游：5′⁃GTGGAC⁃ 洗 3 次，每次10 min；天能凝胶成像系统曝光显影。
GGGTCGATGTCAC⁃3′；TNF⁃α（mouse）上游：5′⁃AC⁃ 1.3 统计学方法
GGCATGGATCTCAAAGAC⁃3′，下游：5′⁃GTGGGT⁃ 实验数据使用 GraphPad Prism 8 软件进行统计
GAGGAGCACGTAGT⁃3′；IL⁃6（mouse）上游：5′⁃TC⁃ 学分析及作图，计量数据用均数±标准差（x ± s）表
TATACCACTTCACAAGTCGGA⁃3′，下游：5′⁃GAATT⁃ 示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多组样本
GCCATTGCACAACTCTTT⁃3′。 均数比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）。
1.2.5 小鼠结肠固有肌层单个核细胞的提取 P＜0.05为差异有统计学意义。
将结肠切成0.5 cm 片段，加入EDTA（2% FBS +
2 结 果
0.5 mmol/L EDTA+10 mmol/L HEPES），37 ℃震荡
40 min 去除上皮细胞。筛网过滤，加入胶原酶溶液 2.1 HCQ可减轻DSS小鼠肠道炎症
（2%FBS+胶原酶Ⅳ+DNA 酶Ⅰ），37 ℃、220 r/min 震 与 DSS 组相比，HCQ 干预的 DSS 模型小鼠体重
荡 15 min 充分消化。筛网过滤，收集上清，离心后 下降延缓（图1B）、DAI评分明显降低（图1C）。结肠
加入 4 mL 40% Percoll 溶液重悬，缓慢加入 2 mL 大体外观：HCQ干预的DSS模型小鼠结肠黏膜充血
75% Percoll 溶液，2 000 r/min、20 ℃离心 20 min，吸 水肿程度减轻，一定程度上恢复了结肠长度（图
取中间层细胞加入RPMI⁃1640溶液重悬。行流式细 1D、E）。此外，HCQ 干预的小鼠结肠组织病理学评
胞术检测或用于其他实验。 分改善，结肠上皮及隐窝、腺体结构的破坏减轻，炎
1.2.6 流式细胞术检测M1型巨噬细胞比例 性细胞的浸润明显减少（图1F、G）。
调整流式管中细胞数为 5×10 ~1×10 个，加入 2.2 HCQ抑制模型鼠结肠中M1型巨噬细胞极化
6
5
100 μL抗体混合液（FITC⁃CD45、Percp/cy5.5⁃CD11b、 提取各组小鼠结肠固有肌层单个核细胞（lamina
APC⁃F4/80、PE⁃CD86），轻弹混匀，4 ℃ 避光孵育 propria mononuclear cell，LPMC），流式细胞术检测小
30 min。加入 3 mL PBS，300 r/min 离心 5 min，重 鼠结肠LPMC中M1型巨噬细胞的比例。结果显示，
复 1 次。然后加入 300 μL 流式染色缓冲液重悬细 与对照组相比，DSS组小鼠肠道M1型巨噬细胞比例
