Page 40 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第2期
·182 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年2月

VA）检验，多组间比较采用 Dunnett 法。P < 0.05 为 度及诱导时间设计四因素多水平因子条件筛选最
差异有统计学意义。 佳的小鼠 IL⁃3 的诱导表达条件（图 2A）。经 SDS⁃
PAGE 以及考马斯亮蓝 G250 染色检测，结果显示，
2 结 果
在不同的因素和水平下均可观察到约 16 kDa 处的
2.1 小鼠IL⁃3基因序列优化 蛋白诱导条带，与小鼠IL⁃3理论序列的分子量相符
应用 OptimumGene 算法分析，小鼠 IL⁃3 原始 合；同时可观察到目的蛋白的表达量随着温度的升
TM
核苷酸序列的密码子适应指数（codon adaptation in⁃ 高（16℃~37℃）表现为上升趋势，而 IPTG 单因素的
dex，CAI）和GC含量分别为0.35和47.53%。经优化 变化对目的蛋白表达量的影响程度较小；诱导时间
后，CAI 值和 GC 含量分别提高到 0.97 和 55.50%，优 从 8 h 增加至 16 h 后，目的蛋白的表达量呈下降趋
化前与优化后的核苷酸序列如图1所示。 势（图2B~E）。

2.2 小鼠IL⁃3蛋白的原核表达和条件优化 为了进一步分析选定的四因素及各个水平对
根据不同的菌密度、IPTG 诱导剂浓度、诱导温 小鼠 IL⁃3 的表达量影响情况，将每组实验重复 3 次

Optimized 001 GACACCCACCGTCTGACCCGTACCCTGAACTGCAGCAGCATCGTTAAGGAAATCATTGGT
Original 001 GATACCCACCGTTTAACCAGAACGTTGAATTGCAGCTCTATTGTCAAGGAGATTATAGGG
D T H R L T R T L N C S S I V K E I I GG
Optimized 061 AAACTGCCGGAGCCGGAACTGAAGACCGACGATGAGGGCCCGAGCCTGCGTAACAAGAGC
Original 061 AAGCTCCCAGAACCTGAACTCAAAACTGATGATGAAGGACCCTCTCTGAGGAATAAGAGC
K L P E P E L K T D D E G P S L R N K SS
Optimized 121 TTCCGTCGTGTGAACCTGAGCAAATTTGTTGAGAGCCAGGGTGAAGTGGACCCGGAGGAT
Original 121 TTTCGGAGAGTAAACCTGTCCAAATTCGTGGAAAGCCAAGGAGAAGTGGATCCTGAGGAC
F R R V N L S K F V E S Q G E V D P E DD
Optimized 181 CGTTACGTTATCAAGAGCAACCTGCAAAAACTGAACTGCTGTCTGCCGACCAGCGCGAAC
Original 181 AGATACGTTATCAAGTCCAATCTTCAGAAACTTAACTGTTGCCTGCCTACATCTGCGAAT
R Y V I K S N L Q K L N C C L P T S A NN
Optimized 241 GACAGCGCGCTGCCGGGCGTGTTCATTCGTGATCTGGACGATTTCCGTAAGAAACTGCGT
Original 241 GACTCTGCGCTGCCAGGGGTCTTCATTCGAGATCTGGATGACTTTCGGAAGAAACTGAGA
D S A L P G V F I R D L D D F R K L RR
Optimized 301 TTTTATATGGTTCACCTGAACGATCTGGAAACCGTGCTGACCAGCCGTCCGCCGCAGCCG
Original 301 TTCTACATGGTCCACCTTAACGATCTGGAGACAGTGCTAACCTCTAGACCACCTCAGCCC
F Y M V H L N D L E T V L T S R P P Q PP
Optimized 361 GCGAGCGGTAGCGTTAGCCCGAACCGTGGCACCGTGGAGTGC
Original 361 GCATCTGGCTCCGTCTCTCCTAACCGTGGAACCGTGGAATGT
A S G S V S P N R G T V E CC
画横线的部分表示经优化后的密码子。
图1 优化前和优化后的小鼠IL⁃3的基因序列及其编码的氨基酸序列
Figure 1 The gene sequence of mouse IL⁃3 before and after codon optimization and its corresponding amino acid sequence

后，使用 ImageJ 图像分析软件计算各组 SDS⁃PAGE 达，破碎后的上清液中无可观测的目的蛋白条带
结果中目的条带的面积强度。如图 3 所示，当诱导 （图 4A）。因此，对分离的包涵体变性溶解后，在

2+
条件设置为诱导前菌液度吸光值为 0.6、使用 IPTG 8 mol/L咪唑条件下进行Ni 亲和层析纯化。由层析
终浓度为 1 mmol/L、诱导温度为 37 ℃、诱导时长为 紫外吸收图谱可见，在50%比例的洗脱缓冲液条件
8 h 时，小鼠 IL⁃3 在大肠杆菌中具有平均最高的表 下（咪唑浓度约 250 mmol/L）出现一个明显的洗脱
达量。 峰，进一步收集后经 SDS⁃PAGE 分析确认小鼠 IL⁃3

2.3 小鼠IL⁃3的表达形式分析和纯化表征 成功得到了纯化（图4B）。在经过透析复性后，产物
进一步的诱导表达和超声破碎产物的 SDS⁃ 通过阴离子交换层析进一步纯化，并在低NaCl浓度
PAGE 结果显示，位于 16 kDa 处的小鼠 IL⁃3 存在于 条件下出现洗脱峰。收集主要峰组分进行分析显示
超声破碎后沉淀物中，几乎全部以包涵体形式表 最终纯化的小鼠IL⁃3在SDS⁃PAGE中表现为单一蛋