Page 38 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第2期
               ·180 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年2月


              可与过敏原交联结合，引起细胞活化并释放各类可                            天生物科技公司）。Supersil C4 300Å色谱柱（大连
                                          ［3］
              引起过敏反应的生物活性介质 。因此，肥大细胞                            依利特分析仪器有限公司）。商业化小鼠IL⁃3、SCF
              也是研究过敏性疾病发病机制、诊断方法和治疗策                            （美国 PeproTech 公司）。PE anti⁃mouse CD117（c⁃
              略的重要工具。                                           Kit）Antibody、APC anti⁃mouse FcεRIα Antibody（Bio⁃
                  目前，骨髓来源的肥大细胞已被广泛地用作过                          Legend 公司，美国）。小鼠抗二硝基苯单克隆抗体
              敏反应研究的体外细胞模型，但其应用的前提是需                            （anti⁃DNPIgE）、白蛋白⁃二硝基苯（DNP⁃HSA）、β⁃己
              要通过诱导培养使其分化为成熟的肥大细胞，并且                            糖胺酶底物（4⁃硝基苯基 N⁃乙酰基⁃β⁃D⁃氨基葡萄
                                             ［4］
              在此过程中需要持续给予细胞因子 。白细胞介素                            糖）（Merck公司，美国）。BABL/c小鼠3只（SPF级），
              3（interleukin⁃ 3，IL⁃3）则是促进肥大细胞分化、增殖               6~8周龄，购自南京青龙山动物繁殖场，动物实验经
                                          ［4］
              过程中最重要的细胞因子之一 ，IL⁃3 主要由活化                         南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准（伦理
                          ［5］
              的T细胞产生 ，其完整的一级结构由166个氨基酸                          批文编号：IACUC⁃2007037）。
              组成，其中第 1~26 位氨基酸为信号肽序列（Uniprot                    1.2  方法
              ID：P01586）。尽管国内外已有多个厂家开发了基                        1.2.1 小鼠IL⁃3原核表达载体的构建
              于大肠杆菌重组形式的商品化的小鼠IL⁃3产品，但                               从UniProt（登记号：P01586）、GenBank（登记号：
              长期且持续性地进行肥大细胞的分化和培养仍需                             AAA39291.1）中检索并获取小鼠IL⁃3的氨基酸序列
              要较大的构建和维持成本。为了进一步提高体外                             信息及其对应的核苷酸序列，并委托南京金斯瑞生
              肥大细胞模型构建的效率并降低原代细胞培养过                             物科技股份有限公司进行大肠杆菌偏爱密码子优
              程中的IL⁃3使用成本，构建并且筛选出能够高效生                          化和基因合成，并将其连接至 pET28a（+）表达载体
              产小鼠IL⁃3的表达和纯化体系尤为必要。                              的NcoⅠ和XhoⅠ之间，通过Sanger法测序对构建产
                  本研究针对现有小鼠 IL⁃3 核苷酸序列进行大                       物进行确认。
              肠杆菌偏爱密码子优化，通过构建质粒并筛选其在                            1.2.2 小鼠IL⁃3的诱导表达和条件优化
              大肠杆菌原核表达体系中最佳的菌密度、诱导温                                  取2 μL浓度为0.1 μg/μL的pET⁃28a（+）⁃IL⁃3重
              度、时间和诱导剂浓度等因素，并在纯化后验证其                            组质粒加至100 μL的BL21（DE3）感受态中并于冰上
              在促小鼠肥大细胞分化成熟中的活性，从而为高                             静止30 min，42℃热激70 s后置于冰上静止5 min，加
              效、经济的原代肥大细胞培养奠定物质基础。                              入450 μL LB培养基（胰蛋白胨：10 g/L，酵母粉：5 g/L，
                                                                氯化钠：10 g/L）后于37℃震荡培养1 h。取转化后的
              1  材料和方法
                                                                菌液 100 μL 涂布于固体 LB 培养基（含 50 μg/mL 卡
              1.1  材料                                           那霉素），置于 37 ℃培养过夜。挑取单克隆菌落接
                  E.coli BL21（DE）感受态细胞（南京诺唯赞生物                  种于含有 50 μg/mL 卡那霉素 LB 液体培养基中，并
              科技股份有限公司）；小鼠IL⁃3基因合成、重组质粒                         在37 ℃、240 r/min条件过夜培养。
              构建（南京金斯瑞生物科技股份有限公司）。                                   取培养后菌液，按 1∶100（v/v）再接种至含卡那
                  胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、卡那霉素、三羟甲                         霉素的LB培养基中，按照菌密度、诱导剂浓度、诱导
              基 氨 基 甲 烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane，        温度、诱导时间4个因素进行多因子参数设置，其中
              Tris）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic ac⁃       菌密度是其在 600 nm 处吸光值（A600=0.6 或 0.8），诱
              id，EDTA）、氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，           导剂浓度为 0.3、0.5、1.0 mmol/L 终浓度的 IPTG，诱
              GSSG）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、精氨                 导温度为16 ℃、28 ℃、37 ℃，诱导时间为8 h或16 h。

              酸、甘油、异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthio⁃β⁃ga⁃                按以上因素和水平完成诱导组别设置后，在180 r/min
              lactoside，IPTG）、咪唑、尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇                   转速下按预设条件进行震荡培养，并重复进行3次。
             （dithiothreitol，DTT）、精氨酸、丙烯酰胺/甲叉双丙烯                     将诱导后菌液离心并收集菌体，使用 160 μL
              酰胺 30%溶液（29∶1）、考马斯亮蓝 G250、牛血清白                    10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered sa⁃
              蛋白（bovine serum albumin，BSA）（上海生工生物工              line，PBS）重悬菌体，加入40 μL 5×Laemmli样品缓冲
              程股份有限公司）。HisTrap HP亲和层析柱（5 mL）、                   液，沸水浴中处理10 min。将样品在4 ℃，12 000 r/min

              HiTrap Desalting（5 mL）、Resource Q（1 mL）（Cytiva    条件下离心 10 min 后，取 15 μL 上清液进行 SDS⁃
              公司，美国）。BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云                          PAGE 检测。将电泳凝胶进行考马斯亮蓝染色，使
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