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第43卷第2期          胡昊扬，许志强. 小鼠IL⁃3的原核表达条件优化及其促肥大细胞分化成熟的活性研究［J］.
                  2023年2月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（2）：179-186                        ·181 ·


                用ImageJ软件对凝胶中16 kDa处的诱导条带的面积                      C4 300Å色谱柱（4.6 mm×300 mm）、流动相A为含有
                和强度进行计算，分析各个组别的蛋白表达情况。                            0.1%TFA 和 10%乙腈的水溶液、流动相 B 为含有
                1.2.3 小鼠IL⁃3的表达形式分析                               0.09%TFA 和 80%乙腈的水溶液进行样品的梯度洗
                    将小鼠 IL⁃3 表达菌接种于 3 mL 含卡那霉素的                   脱测定，色谱条件为 0~5 min（100%流动相 A，0%流
                LB 液体培养基中，并在 37℃、240 r/min 条件过夜培                  动相 B）、5~60 min（流动相 A 由 100%至 0%，流动相
                养。将培养菌液进一步转入 300 mL 含卡那霉素                         B由0%至100%），监测280 nm处的紫外吸收信号。
                                                                  1.2.5 小鼠IL⁃3促肥大细胞分化成熟的活性研究
                的 LB 培养基中，在相同的条件下振摇至菌液 A600
                为 0.6 时加入终浓度 1 mmol/L 的 IPTG，并在 37℃、                  按照已报道的方法进行小鼠原代肥大细胞分
                                                                        ［7］
                180 r/min 条件震荡培养 8 h。使用 SDS⁃PAGE 检测               化培养 。首先通过颈椎脱臼法处死小鼠后取其股
                小鼠 IL⁃3 的表达形式：取 IPTG 诱导前菌液、诱导后                    骨，将骨髓细胞冲出后用于后续洗涤和培养处理，并
                菌液，12 000 r/min 离心收集菌体，按上述表达条件                    且分为两组：一组在培养过程中加入终浓度10 ng/mL
                优化中所述电泳步骤处理样品。同时将剩余诱导                             的本研究中纯化的小鼠 IL⁃3 并配合 10 ng/mL 的商
                后菌液离心后，使用PBS洗涤菌体，再次离心后重悬                          业化小鼠 SCF，另一组在培养过程中加入 10 ng/mL
                于 10 mL PBS 中，利用超声破碎仪进行细胞裂解                       商业化小鼠 IL⁃3 并配合 10 ng/mL 的商业化小鼠
               （70%功率，工作 5 s，间隔 5 s，总时长 30 min），取                 SCF，均置于 37 ℃、5% CO2条件下培养。在培养第
                100 μL破碎后产物在4 ℃，12 000 r/min条件下离心                 3 周和第 5 周时分别取样进行肥大细胞分化状态和
                                                                              ［8］
                10 min，分离上清液和沉淀用于SDS⁃PAGE检测。                      细胞比例检测 ，具体如下：将细胞收集后，500 g离
                1.2.4 小鼠IL⁃3的分离纯化                                 心 5 min 后弃上清，使用含 10%胎牛血清的 RP⁃
                    基于上述结果，将超声破碎后的沉淀溶解于变                          MI1640 培养基调整细胞浓度为 1.0×10 /mL，分别移
                                                                                                     6
                性液中（20 mmol/L Tris⁃HCl，0.5 mol/L NaCl，5 mmol/L    取300 μL上述细胞悬液，离心后使用300 μL流式染
                咪唑，6 mol/L 盐酸胍，1 mmol/L DTT，pH 8.0）。将             色缓冲液（含 0.5% BSA 的 PBS 溶液，pH 7.2）重悬，
                HisTrap HP 层析柱装载到ÄKTA层析系统，使用上样                    分别取 100 μL 细胞悬液加入 3 μL PE anti⁃mouse
                缓冲液（20 mmol/L Tris⁃HCl，0.5 mol/L NaCl，5 mmolL     CD117（c ⁃ Kit）Antibody 和 3 μL APC anti ⁃ mouse
                咪唑，8 mol/L 尿素，1 mmol/L DTT，pH 8.0）平衡层析            FcεRIα Antibody，室温孵育 15 min。随后加入 1 mL
                柱后，将变性后的小鼠 IL⁃3 上样至层析柱中，逐                         流式染色缓冲液清洗细胞，500 g 离心 5 min 后弃上
                次 使 用 2% 、4% 、50% 、100% 比 例 的 洗 脱 缓冲液             清，再次加入 300 μL 流式染色缓冲液重悬，采用流
               （20 mmol/L Tris⁃HCl，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L 咪    式细胞仪检测肥大细胞表面特异性标志物FcεRI和
                唑，8 mol/L 尿素，1 mmol/L DTT，pH 8.0）进行洗涤和            CD117的表达水平并计算该细胞群所占比例。
                洗脱，分别收集洗脱峰进行SDS⁃PAGE电泳检测。                             参照已报道的方法进行小鼠肥大细胞被激发
                    根据已报到的方案略作调整进行蛋白质复                            后的β⁃己糖胺酶释放量测定 。使用培养第5周的
                                                                                           ［9］
                性 ［6］ 。具体如下：合并上述洗脱的小鼠IL⁃3，于4 ℃                    肥大细胞与小鼠抗二硝基苯基的 IgE 抗体孵育过
                透析至复性液中（50 mmol/L Tris⁃HCl，0.5 mol/L Na⁃          夜，将细胞收集后，500 g 离心 5 min 后弃上清，并使
                Cl，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L GSH，0.1 mmol/L          用台式液（tyrode’s solution）洗涤并重悬，分组加入
                GSSG，0.5 mol/L精氨酸，10%甘油，pH9.5），持续24 h。            10μL PBS、DNP ⁃ HSA、3% Triton X ⁃ 100 后 ，置 于
                    收集复性后产物，先使用 HiTrap Desalting 层析               37 ℃、5% CO2 条件下培养孵育 30 min。反应结束

                柱将产物溶液置换至离子交换A溶液中（20 mmol/L                       后，离心并吸取 50 μL 上清与 50 μL β⁃己糖胺酶底
                Tris⁃HCl，pH8.5），置换后产物上样至相同溶液平衡                    物混合后，37 ℃孵育1.5 h，随后使用75 μL 0.2 mol/L
                后的 Resource Q 层析柱，使用梯度递增的离子交换                     甘氨酸溶液（pH 10.7）终止反应，并测定405 nm处测
                B溶液中（20 mmol/L Tris⁃HCl，1 mol/L NaCl，pH 8.5）      量其吸光度值，β⁃己糖胺酶释放率计算公式如下：

                进行蛋白洗脱，分别收集不同的洗脱峰进行 SDS⁃                         （ODDNP⁃HSA-ODPBS ）/（ODTriton X⁃100-ODPBS ）×100%。
                PAGE检测分析。同时，按照说明书使用BCA蛋白浓                         1.3  统计学方法
                度测定试剂盒对纯化后小鼠IL⁃3的浓度进行测定。                              实验数据使用 GraphPad Prism 8 软件进行统计
                    基于最终纯化的小鼠IL⁃3，使用反向⁃高效液相                       学分析，各组数据表示为均数±标准差（x ± s），多组
                色谱法对其进行纯度测定，具体如下：使用 Supersil                      定量资料比较采用单因素方差分析（one⁃way ANO⁃
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