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第43卷第2期          胡昊扬，许志强. 小鼠IL⁃3的原核表达条件优化及其促肥大细胞分化成熟的活性研究［J］.
                  2023年2月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（2）：179-186                        ·185 ·


                    A               purified IL⁃3    B              purified IL⁃3    C
                                   commercial SCF                 commercial SCF
                                                                                         2.0       ***
                           10 5                            10 5
                           10 4                            10 4                          1.5
                                  Q1   Q2                        Q1   Q2                nm处吸光度  1.0
                         PE⁃A  10 3          23.3%       PE⁃A  10 3         67.8%               ***
                                                                 Q3   Q4                 0.5
                                  Q3   Q4                                               405
                           10 2                            10 2
                                                                                         0.0
                             0                              0
                                                                                                  Triton X⁃100
                          -109                            -119                                PBS DNP⁃HSA
                             -84 0 10 2  10 3  10 4  10 5   -108 0 10 2  10 3  10 4  10 5
                                      APC⁃A                          APC⁃A
                    D                                E                               F
                                   commercial IL⁃3                commercial IL⁃3
                                   commercial SCF                 commercial SCF
                                                                                         2.0
                           10 5                            10 5                                    ***
                           10 4   Q1   Q2                  10 4  Q1   Q2                nm处吸光度  1.5
                         PE⁃A  10 3          19.4%       PE⁃A  10 3         57.5%        1.0

                                  Q3   Q4                        Q3   Q4                405  0.5  ***
                           10 2                            10 2
                                                                                         0.0
                             0                              0
                                                                                                  Triton X⁃100
                          -127                            -111                                PBS DNP⁃HSA
                            -3460 10 2  10 3  10 4  10 5    -144 0 10 2  10 3  10 4  10 5
                                      APC⁃A                          APC⁃A
                   A~C：使用本研究中纯化的小鼠IL⁃3配合商业化SCF培养原代肥大细胞3周（A）、5周（B）的分化结果及肥大细胞释放β⁃己糖胺酶的功能
                分析（C）；D~F：使用商业化小鼠IL⁃3配合商业化SCF培养原代肥大细胞3周（D）、5周（E）的分化结果及肥大细胞释放及肥大细胞释放β⁃己糖
                胺酶的功能分析（F）。横坐标APC为细胞表面FcεRIα受体的流式检测数值；纵坐标PE为细胞表面CD117（c⁃Kit）的流式检测数值；Q2圈定区
                域为FcεRI CD117 肥大细胞占比。两组比较， P < 0.001（n=4）。
                            +
                                               ***
                       +
                                                  图5   流式细胞术分析肥大细胞分化
                        Figure 5 Analysis of the differentiation of mast cells from mouse bone marrow cells by flow cytometry
                因此对于其原核表达条件建立和优化尤为必要。                             了筛选小鼠 IL⁃3 原核表达的最佳条件，本研究根
                    在异源表达系统中，密码子优化可提高了靶基                          据菌培养密度、诱导剂浓度、诱导时温度和诱导时
                因的翻译效率，从而尽可能地提高宿主中原始物种                            长 4 个因素进行了多个代表性水平的因子参数设
                DNA序列编码的蛋白质表达            ［11］ 。因此在本研究中，           置。经过 3 次重复实验后发现诱导前菌密度 A600为
                首先针对小鼠 IL⁃3 的原生核苷酸序列进行大肠杆                         0.6 时且 IPTG 终浓度为 1.0 mmol/L，在 37 ℃条件下
                菌偏爱密码子优化，使其CAI指数和GC含量均得到                          诱导 8 h 具有最高的蛋白表达量，而诱导前菌密度
                了提升。根据 OptimumGene 算法工具优化原则，                      A600为0.8时、诱导温度为16 ℃或28 ℃时、诱导时长
                                         TM
                核苷酸序列的 CAI 指数高于 0.8 时被定义为具有高                      为16 h时均呈现不同程度的蛋白检测量降低，这可
                基因表达水平，本研究中优化后的序列 CAI 从优化                         能分别与细菌生长超过对数期、低温影响了细菌的
                前的 0.35 升高至 0.97，属于从根本层面对小鼠 IL⁃3                  生长、过久的培养导致营养不再充分或代谢物累积
                的表达进行了优化。优化后的序列经过基因合成                             影响细菌状态等有关。
                后克隆至 pET⁃28a（+）载体质粒，通过该质粒的 Nco                        通过表达形式分析，本研究构建的小鼠IL⁃3表
                Ⅰ和XhoⅠ位点进行了连接并且保留了羧基端的6个                          达质粒在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达，这可
                组氨酸标签，该标签不仅极大的提高了下游的纯化                            能 与 其 含 2 对 分 子 内 二 硫 键 有 关（Uniprot ID：
                效率，并且为诱导表达后的目的蛋白验证提供了靶                            P01586），其在大肠杆菌中错误配对可能是形成包

                点，本研究中诱导表达以及最终纯化后的小鼠 IL⁃3                         涵体主要原因。因此，为了获得具有生物活性的蛋
                均通过Western blot进行了组氨酸标签检测（数据未                     白，必须进行包涵体变性和复性使IL⁃3恢复折叠和
                展示）。异源基因能否在大肠杆菌高效表达受到多                            活性构象。我们首先使用Ni 亲和层析对变性后的
                                                                                            2+
                种因素的影响，而表达条件的优化则能够在合适的                            IL⁃3 进行粗捕获，并进一步利用氧化还原复性体系
                条件下最大程度提高目的蛋白质的获取量                    ［12，13］ 。为  结合透析法对纯化产物复性以促进二硫键的再配
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