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第43卷第2期
               ·188 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年2月


                  糖尿病（diabetes mellitus，DM）是世界上最常见              FBXW7 在 DR 发展中的调控关系及作用机制进行
              的代谢性疾病，由胰岛素缺乏及作用减弱引起 。目                           探讨。
                                                      ［1］
              前全球有10%的人患有DM 。DM会引起微血管并
                                      ［2］
                                                                1  材料和方法
              发症，例如糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，
                                  ［3］
              DR）、肾病和神经病变 。据报道，超过 30% 的DM                       1.1  材料
                         ［4-5］
              患者患有 DR        ，即使积极治疗，仍有 10%的 DR 患                    ARPE⁃19 购自美国模式培养物集存库（Ameri⁃
              者不可避免地会失明 。虽然早期检测和治疗对于                            can type culture collection，ATCC）。 lncRNA VIM ⁃
                                 ［6］
              防治DR非常重要，但是目前可用于 DR早期发现和                          AS1 的 过 表 达 质 粒（overexpression plasmid of ln⁃
              风险预测的诊断性生物标志物仍需要探索。                               cRNA VIM⁃AS1，OE⁃VIM⁃AS1）、短发夹⁃FBXW7（sh⁃
                  长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）          FBXW7）、miR⁃497⁃5p 模拟物（miR⁃497⁃5p mimics）、
              是指转录本超过 200 nt 的单链 RNA，参与调控许多                     miR⁃497⁃5p 抑制剂（miR⁃497⁃5p inhibitror）及其阴性
              生物过程 。已有研究表明，lncRNA与DR发生和发                        对照组（pcDNA3.1、shRNA、mimics/inhibitror NC）（上
                      ［7］
              展密切相关，可作为DR诊断和治疗的潜在靶点                     ［8-9］ 。  海吉玛基因）。双荧光素酶报告基因测定系统（北
                        ［10］
              例如，Liu等 研究揭示了lncRNA MALAT1敲低可以                    京Promega 公司）。细胞计数试剂盒⁃8（cell counting
              抑制高糖（high glucose，HG）环境下的人视网膜微血                   kit⁃8，CCK⁃8）（上海生工公司）。Annexin V⁃FITC 凋

              管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial     亡 检 测 试 剂 盒 、BCA 试 剂 盒（Beyotime 公 司 ，上
              cell，hRMEC）的小管形成。Zhang 等          ［11］ 研究显示       海）。SYBR 试剂盒（Thermo Fisher Scientific 公司，
              lncRNA AK077216过表达显著抑制人视网膜色素上                     美国）。
              皮细胞（human retinal pigment epithelial cell，hRPE）   1.2  方法
              的 凋 亡 。 lncRNA VIM 反 义 RNA 1（LncRNA VIM           1.2.1 细胞培养和处理
              Antisense RNA 1，lncRNA VIM⁃AS1）之前被鉴定为                  所有细胞均在含有10%胎牛血清（FBS）（Thermo
              癌症相关的 lncRNA      ［12］ 。最近有研究显示，lncRNA            Fisher Scientific 公司，美国）和 1% 青霉素/链霉素溶
              VIM⁃AS1 在 DM 患者中异常表达         ［13］ 。更重要的是，         液（上海生工）的 DMEM（Thermo Fisher Scientific 公
              lncRNA VIM⁃AS1在DM合并DR患者中表达明显降                     司，美国）中于37 ℃ 5% CO2培养。HG处理为细胞用
              低，lncRNA VIM⁃AS1 过表达明显抑制 HG 处理的                   30 mmol/L D⁃葡萄糖（Sigma⁃Aldrich公司，美国）处理
              hRPE 的细胞凋亡      ［14］ ，表明其在 DR 中起关键作用。             48 h。使用 600 μg/mL 晚期糖基化终末产物（ad⁃
              但 lncRNA VIM⁃AS1 在 DR 中的具体作用机制有待                  vanced glycation end products，AGE）（Biovision 公司，
              进一步探讨。                                            美国）处理细胞，并将其作为HG处理的阳性对照组。
                  微小RNA（microRNA，miRNA）是一种长度约为                  1.2.2 细胞转染
              22 nt的非编码单链RNA分子，参与基因表达的转录                             使用 Lipofectamine TM  3000（Invitrogen 公司，美
              后调控   ［15］ 。先前的一项研究显示，miR⁃497在DM大                 国）将 OE⁃VIM⁃AS1、sh⁃FBXW7 和 miR⁃497⁃5p mim⁃
              鼠的胰腺中显着上调，这表明miR⁃497可能在DM进                        ics/inhibitror 及其阴性对照组（pcDNA3.1、shRNA、
              展中充当某种作用         ［16］ 。此外，Li等  ［17］ 研究显示miR⁃      mimics/inhibitror NC）转染 ARPE⁃19细胞。
              497⁃5p在HG处理的视网膜神经胶质细胞中显著上                         1.2.3 双荧光素酶报告基因检测
              调，miR⁃497⁃5p 过表达显著促进 HG 处理的视网膜                         使用常见的在线工具预测 lncRNA VIM⁃AS1、
              神经胶质细胞的凋亡。                                        miR⁃497⁃5p 和 FBXW7之间的结合位点。 PCR扩增

                  F⁃box 和 WD⁃40 结构域蛋白（F⁃box and WD⁃40           人 lncRNA VIM⁃AS1/FBXW7 片段。使用定点突变
              domain proteins，FBXW7）作为泛素⁃蛋白酶体降解途                试剂盒（Stratagene 公司，美国）对 lncRNA VIM⁃AS1/
              径的关键识别因子之一，被证实在调节 DR 进展中                          FBXW7 片段中的 miR⁃497⁃5p 结合位点进行定点突
              起关键作用。Shao等        ［18］ 证明了 FBXW7 敲低可以促           变检测。将 lncRNA VIM⁃AS1/FBXW7 序列的野生

              进 DR 中的新生血管形成。据报道，DR 小鼠和HG                        型（wild type，wt）和突变型（mutate，mut）报告质粒克
              处 理 的 hRMEC 中 FBXW7 表 达 显 著 降 低 ，并 且              隆到 pmirGLO 载体（上海吉玛基因）中。用 lncRNA
              FBXW7过表达可以抑制HG诱导的血管生成 。因                          VIM⁃AS1⁃wt/FBXW7⁃wt 或 lncRNA VIM⁃AS1⁃mut/
                                                      ［19］
              此 ，本 研 究 对 lncRNA VIM ⁃ AS1、miR ⁃ 497 ⁃ 5p 和      FBXW7⁃mut 质粒和 miR⁃497⁃5p mimics 或 mimics
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