Page 47 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 47

第43卷第2期      居悦俊，郭展宏，王冠怡，等. LncRNA VIM⁃AS1通过miR⁃497⁃5p/FBXW7轴调控高糖环境下视网膜
                  2023年2月        内皮细胞的迁移和凋亡［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（2）：187-195，248 ·189                  ·


                NC 或 miR⁃497⁃5p inhibitor或inhibitor NC 共转染细       公司，美国）和 GAPDH（1∶10 000，Sigma⁃Aldrich 公
                胞Lipofectamine 3000 。使用双荧光素酶报告基因                  司，美国）的抗体在4 ℃下孵育过夜。用PBS⁃T洗涤
                              TM
                测定系统检查荧光素酶活性。                                     后，将膜与用 HRP（1∶10 000，Abcam 公司，美国）标
                1.2.4 伤口愈合试验                                      记的相应二抗孵育60 min。通过GEL成像系统（Bio⁃
                    将细胞接种到 6 孔板（Corning 公司，美国）。当                  Rad公司，美国）对膜进行可视化和成像。通过软件
                细胞融合程度达到约90%时，使用200 μL移液器吸                        Image J分析蛋白质的定量。
                头在融合的细胞单层中产生人工伤口。用PBS洗涤                           1.3  统计学方法
                细胞 3 次并加入无血清培养基培养细胞，使用显微                              本研究使用 GraphPad Prism 8 进行统计数据分
                镜（Olympus公司，日本）在0 h和24 h拍摄图像。                     析。进行的所有实验至少重复3次。测量数据表示
                1.2.5 CCK⁃8检测                                     为均数±标准差（x ± s）。两两比较采用t 检验，多组
                    将细胞接种在 96 孔板中，与 CCK⁃8（10 μL）                  比较采用单因素方差分析。所有数据均来自至少
                一起孵育，并在37 ℃的培养箱中孵育2 h。使用微孔                        3 个重复实验。P < 0.05 表示差异有统计学意义。
                板分光光度计（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）
                                                                  2  结 果
                在450 nm处检测吸光度。
                1.2.6 细胞凋亡测定                                      2.1  HG 处理抑制 ARPE⁃19 细胞的增殖和迁移，同
                    使用Annexin V⁃FITC凋亡检测试剂盒分析细胞                   时通过下调lncRNA VIM⁃AS1促进细胞凋亡
                凋亡。收获细胞并重新悬浮在500 μL的1×Annexin                         首先，评估了不同培养基中的ARPE⁃19细胞中
                结合缓冲液（中国Beyotime）中。细胞在黑暗条件下                       lncRNA VIM⁃AS1 的表达，结果显示 lncRNA VIM⁃
                用 10 μL Annexin V⁃FITC 和 5 μL PI（中 国 Beyo⁃        AS1 在 HG 及 AGE 处理后的 ARPE⁃19 细胞中的表
                time）染色10 min，立即使用流式细胞仪分析样品。                      达分别为 0.40±0.05 及 0.45±0.06，正常培养基（NG）
                1.2.7  定量实时聚合酶链反应（quantitative reverse            组的表达为1.00±0.13，HG组及AGE组与NG相比显
                transcription⁃PCR，qRT⁃PCR）                        著下调，t 值分别为 7.449 及 6.723，P 值分别为 0.002
                    用 TRIzol 试剂（Thermo Fisher Scientific 公司，      及 0.003（图 1A）。为了评估 lncRNA VIM⁃AS1 在
                美国）分离总 RNA。对于 mRNA，使用逆转录酶试                        DR中的功能，用 lncRNA VIM⁃AS1过表达质粒转染
                剂盒（Toyobo公司，日本）合成cDNA。对于 miRNA，                   ARPE⁃19 细胞，并评估细胞表型。qRT⁃PCR结果显
                使用第一链 cDNA 合成试剂盒合成 cDNA。 然后，                      示，转染 OE⁃VIM⁃AS1 后 ARPE⁃19 细胞中 lncRNA
                使用 SYBR 试剂盒将 cDNA 用于 qRT⁃PCR 测定。                  VIM⁃AS1 的表达显著增加（4.51±0.87，t=6.481，P=
                miRNA 和 mRNA 的相对表达分别用 U6 和 GAPDH                  0.003，图 1B）表明转染成功。CCK⁃8 实验显示经过
                为内参，用2     -ΔΔCT 法计算。 研究中使用的引物如下：                 HG 处理后，ARPE⁃19 的细胞活力明显受到抑制
                LncRNA VIM⁃AS1 正义：5′⁃ACTGTAATGGACTCGT⁃           ［（54.06±11.16）%，t=3.346，P=0.028，图1C］。 HG处
                GGTG⁃3′，反义：5′⁃CGTCGTGTTGTCCTGATG⁃3′；              理后，流式细胞检测结果显示 Q2 及 Q3 象限中的细
                miR⁃497⁃5p 正义：5′⁃CCTTCAGCAGCACACTGTGG⁃            胞 凋 亡 明 显 增 加［（18.48 ± 1.65）% ，t=11.86，P <
                3′，反义：5′⁃CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT⁃3′；FBXW7            0.001］。过表达 lncRNA VIM⁃AS1，细胞凋亡减少
                正义：5′⁃ACTGGGCTTGTACCATGTTCA⁃3′，反义：5′⁃            ［（7.69±2.28）%，t=6.640，P=0.003］。这表明 HG 处
                TGAGGTCCCCAAAAGTTGTTG⁃3′；U6 正义：5′⁃CG⁃             理后的ARPE⁃19 细胞的细胞增殖受到抑制，而过表
                CTTCGGCAGCACATATAC⁃3′，反义：5′⁃AAATATG⁃              达lncRNA VIM⁃AS1则逆转这一改变（图1D）。此外
                GAACGCTTCACGA⁃3′；GAPDH 正义：5′⁃TCAAGA⁃              观察到 HG 处理 ARPE⁃19 细胞后，伤口愈合实验显
                AGGTGGTGAAGCAGG⁃3′，反义：5′⁃TCAAAGGTG⁃               示细胞迁移受到抑制［（37.35±5.77）%，t=5.631，P=
                GAGGAGTGGGT⁃3′。                                   0.005］。过表达 lncRNA VIM⁃AS1 后细胞迁移增加
                1.2.8 蛋白质印迹法                                     ［（65.60±8.87）%，t=5.299，P=0.006，图 1E］。所有这

                    用RIPA 分离蛋白质，用BCA 试剂盒（中国Bey⁃                   些结果表明，HG 处理抑制了 ARPE⁃19 细胞的增殖
                otime）测定蛋白质浓度。样品通过 8%~12% SDS⁃                    和迁移，同时通过降低 lncRNA VIM⁃AS1 表达促进
                PAGE 分离，进一步转移到 PVDF 膜（Millipore 公司，               了细胞凋亡。
                美国）。然后将膜与针对 FBXW7（1∶1 000，Abcam                   2.2  LncRNA VIM⁃AS1 在 ARPE⁃19 细胞中通过海
   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52