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第43卷第3期           何树燕，沈      冬，林青凤，等. CCT2对肺腺癌细胞增殖、迁移的影响及其临床意义［J］.
                  2023年3月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（3）：319-325                        ·321 ·


                10%~30%，或者染色强度弱到中等，但阳性染色细                         100 μL样品加入25 μL 5×SDS⁃PAGE蛋白上样缓冲
                胞百分比为 30%~50%；+++：染色强阳性细胞≥                        液，摇匀后 100 ℃变性 5~10 min。将蛋白样品进行
                30%，或者阳性染色细胞百分比≥50%              ［10］ 。为了确定       PAGE 电泳，湿转至甲醇浸润过的聚偏二氟乙烯
                CCT2表达是否与临床病理特征相关以及与Ki⁃67表                       （polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用50 g/L脱脂
                达的相关性，将所有肺腺癌患者分为 CCT2 高表达                         奶粉封闭 1.5 h，用含吐温⁃20 的 PBS 洗膜 3 次，每次
                组和低表达组、Ki⁃67高表达组和低表达组（染色强                         10 min，加入兔抗 CCT2（1∶20 000）、兔抗 GAPDH
                度-、+为低表达，++、+++为高表达）。                            （1∶10 000）4 ℃摇床过夜；去除一抗液，用 PBST 洗
                1.2.3 细胞培养及转染                                     膜3次，每次10 min，加入二抗羊抗兔IgG（1∶5 000），
                    人肺腺癌细胞A549、H1650、H1299和人肺上皮                   室温孵育1.5 h，洗涤后采用化学发光法曝光。
                BEAS⁃2B 细胞购自中国科学院细胞库。细胞培养                         1.2.6 CCK⁃8增殖实验

                条件：RPMI 1640培养基、RPMI DMEM 培养基、10%                     用胰蛋白酶消化对数生长期的肺腺癌细胞，制
                胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco 公司，美           成单细胞悬液，调整细胞密度为 2×10 个/mL。取
                                                                                                      4
                国），置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育。收集对数生                       100 μL细胞悬液接种到96孔板中，每孔设置6个复
                长期的 A549、H1299、H1650 细胞进行转染实验，以                   孔，继续培养 24 h 后进行细胞转染，分为 si⁃NC 组
                1×10 个/孔的密度接种于6孔细胞板，常规培养24 h，                    （阴性对照组）和 si⁃CCT2 组（转染组），分别在转染
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                分为 si⁃NC 组和 si⁃CCT2 组，参照 Lipofectamine      TM    0、24、48 h 时终止培养，每孔加入 CCK⁃8 试剂 10 μL
                2000试剂盒说明书步骤操作，放置培养箱中继续培                          后继续放入培养箱孵育2 h，最后在酶标仪上测各孔
                养24 h，收集各组细胞利用实时荧光定量PCR（qRT⁃                      450 nm波长处的吸光度值，绘制细胞生长曲线。
                PCR）和Western blot法检测转染效率。                         1.2.7 细胞划痕实验
                1.2.4 逆转录⁃聚合酶链反应（qRT⁃PCR）                             取对数生长期的肺腺癌细胞，胰酶消化并以
                    采 用 Trizol 试 剂 分 别 提 取 人 肺 腺 癌 A549、          3×10 个/孔的密度接种到6孔板中，放置培养箱中孵
                                                                      5
                H1299、H1650 细胞和人肺上皮 BEAS⁃2B 细胞株的                  育 24 h，用 200 μL 枪头在每孔中间划线，然后吸尽
                总 RNA，进行逆转录合成 cDNA。扩增系统如下：                        培养基，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，
                cDNA 1 μL，上游和下游引物各 0.4 μL，2× Trans⁃               PBS）洗涤 2 遍，每孔加入含 1%FBS 的 RPMI1640 培
                     ®
                Script Tip Green qPCR Super Mix 10 μL，50× Pas⁃    养基，分别在0、24 h时置于显微镜下拍照。
                sive Reference染料0.4 μL，无RNA酶水补充至20 μL。            1.3  统计学方法
                设计正、反向引物（表1），引物合成和测序由上海生工                             实时荧光定量 PCR 结果采用 2            - ΔCT  进行分析。
                生物公司完成。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；                     采用 SPSS 21.0 和 GraphPad Prism 8.0 软件对数据进
                95 ℃变性15 s，62 ℃退火10 s，共进行40个循环。                   行统计分析和绘图。计量资料采用均数±标准差（x
                                                                  ± s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间
                              表1 PCR引物的信息                         比较采用方差分析（ANOVA）；计数资料采用频数表
                        Table 1 Information of PCR primers        示，两组间比较采用χ 检验，不满足χ 检验的条件时采
                                                                                    2
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                    基因                  引物序列（5′→3′）
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                  CCT2             F:AGGGGATTCACTTGTGTGCG
                                   R:TTGTCCATGCCTTTGGGTCC         2  结 果
                  GAPDH            F:GAAGGTGAGGTCGGAGTC
                                                                  2.1  CCT2与肺腺癌预后的相关性分析
                                   R:GAGATGGTGGGTTC
                                                                      首先利用GEPIA网站分析了TCGA数据库中肺
                1.2.5 Western blot实验                              腺癌患者和 GTEx 数据库中正常人体组织中 CCT2
                    收集细胞，PBS 洗涤 2 次，去除上清，每个样品                     的表达。在肺腺癌患者中，CCT2的表达水平显著高
                加 入 100 μL RIPA 裂 解 液 + 1 μL 苯 甲 基 磺 酰 氟          于正常组织（图 1A），CCT2 高表达肺腺癌患者的总
               （phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）后 放 置 冰 上      体生存率低，差异有统计学意义（P＜0.05，图 1B），
                30 min，每隔 10 min 摇匀 1 次，然后在 12 000 r/min、         分期越晚 CCT2 表达水平越高（图 1C），但差异无统

                4 ℃离心 15 min，收集上清并用二喹啉甲酸（bicin⁃                   计学意义（P＞0.05）。这表明CCT2可能是评价肺腺
                choninic acid，BCA）试剂盒检测其蛋白浓度。每                    癌患者预后的指标之一。
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