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第43卷第3期         孙上雯，陈汉帮，胡姝颖，等. 负载γ⁃Fe2O3的壳聚糖多孔海绵对大鼠骨髓间质干细胞增殖和
                  2023年3月             成骨分化的影响［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（3）：326-333                    ·327 ·


                Conclusion：The chitosan porous sponge loaded with γ ⁃ Fe2O3 promoted the proliferation and the early indicators of osteogenic
                differentiation of rBMSC，and loading γ⁃Fe2O3 at concentration of 5% and 10% can promote the formation of mineralization in the late
                stage of osteogenic differentiation of rBMSC.
               ［Key words］ γ⁃Fe2O3 magnetic nanoparticle；chitosan porous sponge；bone tissue engineering；osteogenesis differentiation
                                                                              ［J Nanjing Med Univ，2023，43（03）：326⁃333］



                    感染、创伤、肿瘤或先天性疾病等原因导致的口                         rBMSC）增殖及成骨分化的影响。
                腔牙槽骨缺损的修复方法一直是医学难题                   ［1-2］ 。随着
                                                                  1  材料和方法
                人们对口腔问题的重视，口腔颌面部的骨修复需求
                正在迅速增长。目前，自体骨移植仍然是修复骨缺                            1.1  材料
                损最主要的方法        ［3-4］ ，然而从自体获得的骨量有限，                   壳聚糖（脱乙酰度≥95%，上海 Macklin 公司），
                取骨后的局部血肿、新骨植入时的塑形等问题都值                            冰乙酸（纯度> 99%，北京 PSAITONG 公司），聚乙二
                得关注   ［5-6］ 。近年来，骨组织工程的发展为解决这一                    醇 二 缩 水 甘 油 醚（poly ethylene glycol diglycidyl
                难题开辟了新途径。                                         ether，PEGDGE）（北京 Solarbio 公司）；rBMSC（P2）、
                    骨组织工程包含三要素：干细胞或前体细胞、                          rBMSC 完全培养基及成骨诱导培养基（广州 Cyagen
                生物支架和生长因子。天然骨组织具有很强的再生                            公司），0.25%胰酶⁃EDTA（Gibco公司，美国），磷酸盐
                能力，因为其内部细胞具有干细胞特性。骨髓间充质                           缓 冲 液（phosphate buffered solution，PBS）（Hyclone
                干细胞来源于中胚层，增殖能力强，具有自我更新及                           公司，美国）；CCK⁃8试剂盒（合肥Biosharp公司），活
                                                       ［7］
                多向分化潜能，是骨组织工程理想的种子细胞 。                            死细胞染液（Invitrogen 公司，美国），BCIP/NBT 碱性
                    过去 30 年，人们发现水凝胶材料具有极为亲                        磷酸酶（alkaline phosphatases，ALP）显色试剂盒（上
                水的三维网络结构，可塑性强，是良好的多功能载                            海碧云天生物技术有限公司），ALP活性检测试剂盒
                  ［8］
                体 。壳聚糖是一种天然多糖甲壳素脱除部分乙酰                           （南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量试剂盒
                基的产物，具有与糖胺聚糖相同的结构，常被用于                           （北京雷根生物技术有限公司）；茜素红染色液（广
                          ［9］
                制作水凝胶 。壳聚糖溶解酶可以把壳聚糖降解成                            州 Cyagen 公司）,氯化十六烷基吡啶（cetylpyridinium
                无毒可吸收的小分子氨基酸和多糖                 ［10］ 。壳聚糖分        chloride，CPC）（合肥博美生物科技有限责任公司）；
                子结构中的氨基基团反应活性强，使得该多糖具有                            RNA 提取试剂盒、RT⁃PCR 逆转录试剂盒、SYBR
                优异的生物学功能并能进行化学修饰反应，壳聚                             Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa公司，日本）；5500R
                糖的修饰（比如共价交联和硫化）可以改变其降解                            万能试验机（Instron公司，美国），Spectra Max 190酶
                性质  ［11］ 。由于良好的生物相容性、生物降解性和抗                      标仪（Molecular Device 公司，美国），MAIA3 场发射
                                                       ［12］
                菌作用，壳聚糖基支架已被广泛用于生物医学 。基                           扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）（TES⁃
                于壳聚糖的纳米纤维支架可以模拟细胞外基质，有促                           CAN 公司，捷克），LSM 710激光共聚焦显微镜（con⁃
                                                     ［13］
                进干细胞体外黏附、增殖和成骨分化的能力 。                             focal laser scanning microscope，CLSM）（Carl Zeiss 公
                                                                  司，德国），QuantStudio7荧光定量PCR仪（ABI公司，
                    近来人们对铁基纳米材料的研究发现，γ⁃Fe2O3
                纳米粒子由于良好的生物相容性和特殊的磁学性                             美国）。γ⁃Fe2O3 （纳米材料）由东南大学江苏省生物
                能对骨修复有良好效果           ［14-17］ 。体外研究表明，磁场           材料与设备重点实验室提供。
                诱导下的γ⁃Fe2O3能够促进原代骨髓细胞向成骨细胞                        1.2  方法
                分化，加快细胞的成骨作用以促进骨修复                  ［2，18］ 。也有    1.2.1 材料制备
                研究考察了γ⁃Fe2O3对细胞成骨的直接生物学作用，                            将 0.1 g 壳聚糖溶于 8 mL 0.5%乙酸，磁力搅
                在不施加磁场时，γ⁃Fe2O3能够通过激活丝裂原活化                        拌机混匀，分别加入 0.1、0.5、1.0、2.0 mL 浓度为
                蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）       3 mg/mL的γ⁃Fe2O3溶液，并设空白对照组；加入壳聚
                通路，促进间充质干细胞的成骨分化 。                                糖实际重量 10%的交联剂 PEGDGE，并用去离子水
                                                ［19］
                    因此，本研究通过制备负载γ⁃Fe2O3的壳聚糖多                      补齐 10 mL，制成 5 组体积浓度分别为 0（空白对
                孔海绵支架，探究其在不同负载浓度下对大鼠骨髓                            照）、1%、5%、10%、20%的溶液。搅拌均匀后按每孔
                间质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cell，      100 μL加入96孔板。置于-40 ℃冰箱冷冻8 h，冷冻
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