Page 38 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第3期
               ·328 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年3月


              干燥机冻干 24 h，放入 37 ℃烘箱交联 48 h，得到直                        成骨诱导至第 7、14 天，弃原培养基，PBS 清洗
              径 5.5 mm、高度 6.0 mm 的圆柱体海绵样品：CH0、                  1 次，每孔加入 200 μL 的 0.5% Triton X⁃100 溶液裂
              CH1、CH5、CH10和CH20。环氧消毒后密封保存。                      解20 min，超声，离心，收集上清液，ALP活性和总蛋
              1.2.2 材料性质鉴定                                      白浓度分别按照 ALP 活性检测试剂盒和 BCA 蛋白
                  使用冷冻干燥机将海绵冻干 2 h，喷金 2 min，                    检测说明书进行检测。
              SEM 下观察海绵结构，使用 X 射线能谱仪（energy                     1.2.7 茜素红染色
              dispersive spectrometer，EDS）分析元素分布和占比                  成骨诱导至第21、28天，加入4%多聚甲醛固定
              情况。                                               30 min，PBS 清洗 1 次。将材料浸入茜素红染液，室
                  每组取 20 块海绵冷冻干燥机冻干 8 h，测量海                     温 避 光 染 色 5~10 min，每 孔 加 入 500 μL CPC 液
              绵原质量；每组取160块海绵置于培养基中，37 ℃培                        （10% wt）溶解矿化物，酶标仪550 nm波长下检测吸
              养，每周每组各取 20 块海绵用 PBS、去离子水和无                       光度值。
              水乙醇分别清洗3遍，置于-40 ℃冰箱冷冻2 h，冷冻                       1.2.8 实时荧光定量PCR
              干燥机冻干 8 h，测量海绵总质量。降解率=（1-冻                             成骨诱导第 7、14 天，弃原培养基，胰酶消化后
              干后质量/原质量）×100%。                                   离心，使用 RNA 提取试剂盒收集细胞并分离总
                  使用万能试验机以0.1 mm/s的压缩速度测量压                      RNA，逆转录为 cDNA。采用 SYBR Premix Ex Taq
              缩距离为5 mm时海绵的力学性能。                                 Ⅱ试剂盒配成10 μL反应体系并进行实时荧光定量
              1.2.3 细胞培养                                        PCR，检测成骨指标 ALP、骨形态发生蛋白（bone
                  将 rBMSC 培养在 37 ℃、5% CO2 的恒温培养箱                morphogenetic protein 2，Bmp2）、胶原蛋白（collagen
              中，隔天换液，待其融合至约80%传代。第3~5代细                         I，Col1）和 Runt 相关转录因子 2（core binding factor
              胞用于后续细胞实验。                                        alphal 1，Runx2）基因的表达。引物由上海生工生物
              1.2.4 细胞黏附检测                                      工程有限公司合成，管家基因GAPDH设为内参。
                  将海绵置于48孔板中，每块海绵中接种3×10 个                      1.3  统计学方法
                                                         3
              细胞，培养 0.5 h，镜下观察细胞基本贴壁，每孔加                             采用 SPSS 21.0 统计分析软件，实验数据以均
              500 μL培养基。培养24 h后，弃原培养液，PBS清洗                     数±标准差（x ± s）表示，组间比较采用单因素方差分
              1遍，每孔加入 0.5 mL 4%多聚甲醛固定 30 min 后，                 析，两两比较采用 LSD⁃t 检验，P < 0.05 为差异有统
              PBS 清洗 1 遍。分别用浓度梯度 30%、50%、70%、                   计学意义。
              90% 和 100% 乙 醇 脱 水 10 min，冻 干 2 h，SEM 下
                                                                2  结 果
              观察。
                  培养细胞至第 5 天，将海绵浸入活死细胞染液                        2.1  材料表征
              15 min，PBS清洗3遍，CLSM下观察。                                扫描电镜下，壳聚糖海绵表面疏松多孔（图
              1.2.5 细胞增殖检测                                      1A）。海绵孔隙率为（91.61± 0.70）%，各组差异无统
                  每块海绵中接种 2×10 个细胞，同样方法分别                       计学意义（P > 0.05）。
                                      4
              培养至 1、3、5、7 天，弃原培养液，每孔加入 500 μL                        EDS 元素分析示 Fe 元素均匀弥散分布（图 1B、
              CCK⁃8工作液（CCK⁃8与完全培养基按1∶10混合），                     C）。CH0、CH1、CH5、CH10 和 CH20 组 Fe 元素占比
              37 ℃、5% CO2 恒温培养箱中孵育 2 h，每孔吸出                     分别约为0、0.1%、0.5%、0.9%和1.9%。
              100 μL 液体至 96 孔板中，酶标仪 450 nm 波长下检                      第8周时海绵降解率约为49.14%（图1D），各组
              测吸光度值。                                            间差异无统计学意义（P > 0.05）。
              1.2.6 细胞成骨诱导及ALP检测                                     使用万能力学系统测量海绵力学性能，压缩距
                  每块海绵中接种3×10 个细胞，培养1 d后加入                      离为 5 mm 时，海绵压缩弹性模量（自动杨氏）为
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              成骨诱导培养基，隔天换液。在成骨诱导7 d后，弃                          （125.53 ± 0.52）MPa（图 1E），各组间差异无统计学
              原培养基，PBS 清洗 1 次，每孔加入 0.5 mL 4%多聚                  意义（P > 0.05）。
              甲醛固定 30 min，配制 BCIP/NBT ALP 显色工作液，                2.2 细胞黏附
              每孔加入0.5 mL，室温避光染色30 min，PBS清洗1次，                       rBMSC 接种第 1 天，扫描电镜下见细胞紧密黏
              倒置显微镜下观察。                                         附于海绵表面（图2）。rBMSC接种第5天，活死细胞
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