Page 54 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 54

第43卷第3期
               ·344 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年3月


                                                                           ［12］
             （transition zone，TZ）的门控结构，该结构不仅将初级                 140，IFT140） ，定位于纤毛轴丝附近并借助其转运
              纤毛的内部空间与胞质分隔，也将初级纤毛膜与胞                            的肌醇多聚磷酸 5⁃磷酸酶（inositol polyphosphate⁃5⁃
              膜分隔，在纤毛内形成“隔间”，使纤毛的蛋白组成                           phosphatase E，INPP5E） ，以及 Hedgehog 信号通路
                                                                                     ［13］
                                  ［2］
              和胞膜、胞质有所不同 。初级纤毛内部不存在蛋                            膜受体SMO（smoothened，属于GPCR家族，Hedgehog
              白质翻译和合成系统，因此其各蛋白组分依赖纤毛                            信号通路的活化因子）和 G 蛋白偶联受体 161（G
              内转运（intraflagellar transport，IFT）运输。IFT 家族        protein⁃coupled receptor 161，GPR161，Hedgehog信号
              蛋白根据其生化性质及运输方向的不同主要分为                             通路的抑制因子） 。
                                                                                ［4］
              两类：IFT⁃A 和 IFT⁃B，分别负责纤毛内物质的反向                          3 种固定试剂对应的温度、时间均为该试剂最
                            ［3］
              运输和正向运输 。                                         适合的固定条件。本研究着重探究不同固定方法
                  目前已发现初级纤毛与多种信号转导通路有                           对各类初级纤毛蛋白免疫荧光染色效果的影响，对

              关，包括 Hedgehog 信号通路、G 蛋白偶联受体（G                     于同样可能影响荧光染色效果的透化条件、封闭条
              protein⁃coupled receptor，GPCR）信号通路、Wnt 信号         件以及抗体选择，采用前期实验中已成熟的方案，
              通 路 、转 化 生 长 因 子（transforming growth factor，      而不考虑这些条件可能造成的染色效果的差异。
                                ［1］
              TGF）⁃β信号通路等 。其中 Hedgehog 通路是一个
                                                                1  材料和方法
              公认的典型纤毛相关信号系统，通路内有多种蛋白
              定位并富集于初级纤毛，常在初级纤毛研究中作为                            1.1  材料
                                         ［4］
              观察纤毛功能是否正常的标志 。初级纤毛在信号                                 实验中使用的永生化 MEF 细胞、RPE1 细胞为
              转导中发挥着重要作用，因此初级纤毛结构或功能                            本实验室保存；LSM900 激光共聚焦显微镜（Carl
              缺陷会导致一系列纤毛相关的综合征，被统称为                             Zeiss 公司，德国）；DMEM 细胞培养基（Gibco 公司，
             “纤毛病”。这些疾病往往累及多组织、多器官，常                            美国），DMEM/F12 细胞培养基（南京凯基公司），胎
              见症状如唇裂、多趾、多囊肾、心脏发育不全、小脑                           牛血清（Gibco 公司，美国），青霉素/链霉素（苏州新
                        ［5］
              共济失调等 。                                           赛美公司）；明胶（上海碧云天），4%多聚甲醛（para⁃
                  在探究某种初级纤毛疾病可能的分子病因时，                          formaldehyde，PFA）（北 京 Solarbio 公 司），甲 醇
              细胞免疫荧光是观察纤毛结构、蛋白定位、蛋白富                            （MeOH，南京化学试剂），三氯乙酸（trichloroacetic
              集是否异常必不可少的实验手段。初级纤毛体积                             acid，TCA）（上海麦克林试剂公司）；AC α⁃Tubulin抗
              较小，哺乳动物初级纤毛长度为 1~4 μm ，直径约                        体（Sigma⁃Aldrich 公司，美国），γ⁃Tubulin、SMO 抗体
                                                  ［6］
                    ［7-8］
              300 nm   ，结构层次较多，因此不同蛋白的共免疫                       （Santa Cruz 公司，美国），ARL13B、IFT88、IFT140、
              荧光显示难度较大。在初级纤毛的免疫荧光实验                             MKS1、INPP5E、GPR161抗体（武汉三鹰公司）；荧光
              中，固定是对结构、组分保存最关键的一步，不合适                           二 抗 Goat anti ⁃ Mouse IgG2b 偶 联 488、Goat anti ⁃
              的固定方法不仅容易破坏目的蛋白的纤毛定位，而                            Mouse IgG2a 偶 联 594、Goat anti ⁃ Mouse IgG1 偶 联
              且大大减弱荧光信号。基于以上考虑，本研究尝试                            647、Donkey anti⁃Rabbit IgG（H+L）偶联 594（Invitro⁃
              了3种文献中最常见的固定方法对永生化小鼠胚胎                            gen公司，美国）；DAPI（Sigma⁃Aldrich公司，美国）。
              成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）与人           1.2 方法
              视网膜色素上皮细胞 RPE1 的初级纤毛进行固定，                         1.2.1 细胞培养
              并比较不同定位的纤毛蛋白的染色效果。以组成                                  培养永生化MEF细胞使用DMEM培养基，添加

              纤毛轴丝的乙酰化α⁃微管蛋白（acetylated α⁃Tubu⁃                 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉
                                           ［9］
              lin，AC α⁃Tubulin）作为纤毛标志物 ，分别观察了定位                 素；培养 RPE1 细胞使用 DMEM/F12 培养基，添加
              于纤毛膜上的 ADP 核糖基化因子样蛋白 13B（ADP                      10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉
                                                    ［10］
              ribosylation factor like GTPase 13B，ARL13B） 、纤毛   素；两种细胞均在 5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中进
              基底中心粒的γ微管蛋白（γ⁃Tubulin）、纤毛过渡区                      行培养。在准备免疫荧光实验样品时，将永生化

              的 MKS 过渡区复合物亚基 1（MKS transition zone              MEF细胞和RPE1细胞接种在提前用0.1%明胶孵育
                                     ［11］
              complex subunit 1，MKS1） ，沿轴丝分布的纤毛正                过的细胞爬片上，待细胞长至汇合度 90%时，将培
              向转运蛋白 88（intraflagellar transport 88，IFT88）       养液更换为添加0.2%胎牛血清的DMEM 或 DMEM/
                                                          ［12］
              和 纤 毛 逆 向 转 运 蛋 白 140（intraflagellar transport    F12 培养基进行血清饥饿，持续 24 h以诱导细胞长
   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59