Page 55 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 55

第43卷第3期             李田元，王 悦，艾紫荷，等. 不同固定方法对初级纤毛蛋白免疫荧光的影响［J］.
                  2023年3月                    南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（3）：343-348，379                     ·345 ·


                出初级纤毛。在准备观察SMO的免疫荧光样品时，                               图像拍摄使用 LSM900 激光共聚焦显微镜搭
                进行血清饥饿使用的培养基额外添加200 nmol/L的                       配 63 倍油镜，图像处理使用 ZEN 3.0（blue edition）
                SMO 激动剂（smoothened agonist，SAG），以诱导 SMO           软件。
                在初级纤中富集。
                                                                  2  结 果
                1.2.2 固定方法
                    固定细胞前，吸干细胞培养液，用PBS缓冲液清                        2.1  常用纤毛标志物 AC α⁃Tubulin 的免疫荧光染
                洗细胞两遍。                                            色对比
                    PFA固定：4%PFA长期贮存于-20 ℃，使用时提                        AC α⁃Tubulin作为纤毛轴丝的重要结构组成之
                前解冻，置于 4 ℃保存。细胞浸没在 4%PFA 中，室                      一，常被用作免疫荧光实验中的纤毛标志物。在使
                温下固定30 min，之后用PBS清洗两次。                            用 4%PFA 固定的 MEF 细胞和 RPE1 细胞中，染色
                    MeOH 固定：在使用 MeOH 固定前需将试剂预                     AC α⁃Tubulin 都可以观察到清晰明显的纤毛标记
                冷至-20 ℃。将细胞浸没在预冷后的 MeOH 中，并                      （图 1、表 1）。在使用 MeOH 固定的两种细胞中，染
                立即将容器置于-20 ℃冰箱，固定10 min，如条件允                      色AC α⁃Tubulin观察到的信号稍弱，且在RPE1细胞
                许可将容器直接放置在冰箱制冷管道上以获得最                             中除标记了纤毛轴丝之外还能观察到纤毛基底中
                好的降温效果，之后用PBS清洗两次。                                心体的荧光（图1）。当使用10%TCA固定两种细胞
                    TCA 固定：TCA 于 4 ℃避光保存，10%TCA 固定                时，染色AC α⁃Tubulin标记出的纤毛荧光信号很弱，
                液在使用前现配制，取1/10体积TCA 溶于PBS缓冲                       且存在轻微的不连续，难以找到并观察（图1、表1）。
                液中并置于 4 ℃冰箱预冷。将细胞浸没在预冷的                           2.2 纤毛内多种不同定位蛋白的免疫荧光染色对比
                10%TCA 中，4 ℃条件下固定 20 min，之后用 PBS 清                    ARL13B 是一种小分子 GTP 酶，高度富集于纤
                洗两次。                                              毛膜  ［10］ 。在采用不同固定方法的 MEF 细胞中，
                1.2.3 免疫荧光                                        ARL13B 都显示出了明显的纤毛定位，其中 TCA 固
                    不同固定方法固定细胞后，使用抗体稀释液                           定的纤毛中 ARL13B 信号最强，而 PFA 与 MeOH 固
               （3% BSA、0.3% Triton X⁃100，溶于PBS）4 ℃下封闭并            定的纤毛中信号稍弱且互相之间没有明显差别（图
                透化细胞1 h，之后4 ℃孵育一抗过夜。不同抗体使                         2A、表 1），在 RPE1 细胞中观察到了相同的结果（图
                用的稀释比例：AC α⁃Tubulin 1∶1 000、γ⁃Tubulin 1∶          2B、表1）。
                200、ARL13B 1∶200、IFT88 1∶200、IFT140 1∶500、            在对纤毛基底中心体染色的实验中，可以观察
                MKS1 1∶100、INPP5E 1∶100、GPR161 1∶100、SMO          到 MeOH 固定的 MEF 细胞有更好的γ⁃Tubulin 染色
                1∶50。                                             效果（图 2A、表 1），在 RPE1 细胞中使用 MeOH 和
                    孵育好一抗之后，使用0.2%TBST清洗细胞2次，                     TCA 固定都可以观察到高亮度的中心粒标记（图
                每次 3~5 min，之后室温条件下荧光二抗避光孵 育                       2B、表 1），但 PFA 固定后γ⁃tubulin 染色信号不明
                1 h，不同荧光二抗使用的稀释比例均为1∶200。孵育                       显。与γ⁃Tubulin 的染色结果类似，MeOH 固定细胞
                二抗后，0.2%TBST 清洗细胞 3 次，每次 3~5 min。                 的纤毛过渡区蛋白 MKS1 的荧光信号最明显，而
                最后使用封固剂（含 DAPI）将细胞爬片固定在载玻                         PFA 和 TCA 固定细胞未见定位于过渡区的荧光信
                片上。                                               号（图2，表1）。



                                         MEF                                          RPE1
                          PFA           MeOH            TCA            PFA           MeOH            TCA

                   α⁃Tubulin


                   AC


                               图1   不同固定方法对MEF和RPE1细胞纤毛AC α⁃Tubulin免疫荧光的影响（×630）
                                                   图 1  不同固定方法对 MEF 和 RPE1 细胞纤毛乙酰化 α 微管蛋白免疫1  不同固定方法对 MEF 和 RPE1 细胞纤毛乙酰化 α 微管蛋白免疫1  不同固定方法对 MEF 和 RPE1 细胞纤毛乙酰化 α 微管蛋白免疫
                                                  图
                                                  图
                Figure 1  Different fixation methods and their effects on AC α⁃Tubulin immunolabeling of cilia in MEF and RPE1 cells
                                                                          荧光的影响
                                                                         荧光的影响
                                                                          荧光的影响（×?）（×?）（×?）
                        （×630）                      Fig
                                                    Fig
                                                     Figure1 Different fixation methods and their effects on AC α-Tubulin ure1 Different fixation methods and their effects on AC α-Tubulin ure1 Different fixation methods and their effects on AC α-Tubulin
                                                          immunol
                                                         immunol
                                                          immunolabeling of cilia in MEF and RPE1 cells（×?）abeling of cilia in MEF and RPE1 cells（×?）abeling of cilia in MEF and RPE1 cells（×?）
     图图
      图 1  不同固定方法对 MEF 和 RPE1 细胞纤毛乙酰化 α 微管蛋白免疫1  不同固定方法对 MEF 和 RPE1 细胞纤毛乙酰化 α 微管蛋白免疫1  不同固定方法对 MEF 和 RPE1 细胞纤毛乙酰化 α 微管蛋白免疫
                             荧光的影响（×?）荧光的影响（×?）荧光的影响（×?）
        Figure1 Different fixation methods and their effects on AC α-Tubulin ure1 Different fixation methods and their effects on AC α-Tubulin Figure1 Different fixation methods and their effects on AC α-Tubulin
       Fig
             immunol
             immunolabeling of cilia in MEF and RPE1 cells（×?）abeling of cilia in MEF and RPE1 cells（×?）immunolabeling of cilia in MEF and RPE1 cells（×?）
   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60