Page 56 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第3期
               ·346 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年3月

              表 1  不同固定方法对 MEF 和 RPE1 细胞初级纤毛蛋白免                 PFA 与 TCA 固定细胞可以观察到很弱的 INPP5E 沿
                   疫荧光的影响                                       轴丝分布的荧光信号（图 2A、表 1）。但在 RPE1 细
              Table 1  Different fixation methods and their effects on  胞中，PFA 与 TCA 固定后可以观察到明显、清晰的
                      various proteins immunolabeling of cilia in  INPP5E标记，其中PFA固定后的染色效果优于TCA
                      MEF and RPE1 cells
                                                                （图 2B、表 1）。MeOH 固定的两株细胞都无法观察
                                          固定方法
                纤毛相关蛋白                                          到INPP5E的荧光信号（图2、表1）。
                                  PFA       MeOH       TCA
                                                                2.3  纤毛内 Hedgehog 信号通路相关蛋白的免疫荧
                MEF细胞
                                                                光染色对比
                  AC α⁃Tubulin    +++        ++         +
                                                                     Hedgehog 信号通路是初级纤毛的经典信号通
                  ARL13B           ++        ++        +++
                                                                路，当 Hedgehog 信号被激活时，SMO 蛋白富集到初
                  γ⁃Tubulin        +         +++        +
                                                                级纤毛膜上      ［14］ ，伴随着 GPR161 蛋白移出纤毛         ［15］ 。
                  MKS1             -          +         -
                  IFT88            ++        +++        +       本研究检测了不同固定方法对上述两分子的纤毛
                  IFT140           +          +         +       内定位成像的影响。在MEF细胞中，PFA固定后染
                  INPP5E           -          -         -       色的 SMO 免疫荧光信号最明显，MeOH 固定后染色
                  SMO             +++         +         -
                                                                效果较弱，而TCA固定后的细胞几乎观察不到SMO
                  GPR161           -          +         -
                                                                定位在纤毛的荧光信号（图3A、表1），而GPR161的
                RPE1细胞
                                                                免疫荧光结果显示，只有使用 MeOH 固定后的细胞
                  AC α⁃Tubulin    +++        ++         +
                                                                可以观察到 GPR161 在纤毛的定位（图 3A、表 1）。
                  ARL13B           ++        ++        +++
                                                                在 RPE1 细胞中，仅 PFA 固定适用于 SMO 纤毛内染
                  γ⁃Tubulin        +         +++       +++
                                                                色（图3B、表1）。MeOH固定更适用于GPR161纤毛
                  MKS1             -          +         -
                  IFT88            +         +++        +       染色，尽管 PFA 固定的细胞也有微弱的荧光信号
                  IFT140           ++        ++         +       （图3B、表1）。
                  INPP5E          +++         -        ++
                  SMO              ++         -         -       3  讨 论
                  GPR161           +         ++         -
                                                                     近年来越来越多的研究聚焦于初级纤毛，许多
                 -：未观察到纤毛染色；+：观察到纤毛染色但不明显；++：纤毛
                                                                以往未被关注的蛋白被证明具有重要的纤毛相关
              染色比较明显；+++：纤毛染色明亮清晰。
                                                                功能，阐明这些蛋白发挥功能的分子机制离不开对
                  MEF 细胞的 IFT88 免疫荧光实验发现，MeOH                   其纤毛定位的观察。为了应对研究初级纤毛时涉
              固定的纤毛有着更强的IFT88荧光信号，而且3种固                         及多种蛋白的复杂情况，本研究试图归纳总结出固
              定方法观察到的IFT88定位也有所不同。在PFA固                         定方法与不同种类纤毛蛋白免疫荧光效果之间的
              定细胞中，IFT88信号主要定位于纤毛基底与顶端，                         规律，可以在需要共染两种甚至多种纤毛蛋白时提
              但在 MeOH 固定细胞中，信号富集于纤毛基底部且                         供参考。但是目前结果显示 3 种固定方法互有优
              沿纤毛轴丝较为均匀地分布，在 TCA 固定细胞中，                         劣，适合不同纤毛蛋白的固定条件差异较大，没有
              信号则呈“珠串”状沿轴丝分布（图 2A、表 1）。在                        一种固定方法可使免疫荧光所染蛋白都达到最佳
              PFA 或 TCA 固定后染色的 RPE1 细胞中均观察到                     效果。如果进一步探究纤毛免疫荧光的优化策略，
              IFT88只定位于纤毛基底部，而MeOH固定的细胞中                        需要确定更具体的共染色的蛋白种类。
              IFT88信号定位于纤毛基底与顶端，且信号最强（图                              本研究结果显示，需使用4%PFA进行固定的免
              2B、表1）。3种固定方法对IFT140信号的定位影响                       疫荧光实验中以AC α⁃Tubulin作为纤毛标志物是最
              不大，IFT140 均定位于纤毛基底部，且信号强度没                        佳选择，MeOH 固定后的细胞中 AC α⁃Tubulin 的染
              有明显差异，仅在 TCA 固定的 MEF 细胞中存在“珠                      色效果也可满足作为标志物的需求，而需要使用
              串”状沿轴丝分布的荧光信号（图2，表1）。                             10%TCA 固定的细胞，可以选择 ARL13B 作为纤毛
                  INPP5E 定位于纤毛轴丝附近并通过转运蛋白                       标志物。AC α⁃Tubulin是初级纤毛最内部的骨架结
              与纤毛轴丝间接结合，研究中常把 INPP5E 作为纤                        构，本研究起初怀疑是 PFA 的固定效果比 MeOH 和
              毛转运系统的“货物”进行观察              ［13］ 。MEF细胞中，仅        TCA 更为温和，能更好地保存脆弱的微管结构，从
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