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第43卷第3期
               ·348 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年3月


              A                                               B
                                      MEF                                             RPE1
                       PFA            MeOH           TCA                PFA           MeOH            TCA


                 SMO                                              SMO






                 GPR161                                           GPR161





                            每组3个图,左侧为共标记图像,右上为AC⁃α Tubulin标记染色,右下为相应的蛋白标记染色(×630)。
                       图3 不同固定方法对MEF细胞(A)和RPE1细胞(B)内SMO和GPR161的纤毛定位免疫荧光的影响
              Figure 3  Effects of different fixation methods on immunofluorescence of SMO and GPR161 in proteins cilia of MEF(A)
                       and RPE1 cells(B)

             “分别聚集在 TZ 区两侧”的形态为准,MEF 细胞和
                                                                [参考文献]
              RPE1 细胞的染色效果之间也出现了差异,在一种
                                                                [1] ANVARIAN Z,MYKYTYN K,MUKHOPADHYAY S,et
              细胞中可以成功染色的固定方法在另一种细胞中
                                                                     al. Cellular signalling by primary cilia in development,or⁃
              反而表现不佳。这种现象可能源于两种细胞蛋白
                                                                     gan function and disease[J]. Nat Rev Nephrol,2019,15
              表达的差异,或是源于抗体与不同种属细胞蛋白结
                                                                    (4):199-219
              合效果的差异。类似的是,INPP5E 在 MEF 细胞中
                                                                [2] CHIH B,LIU P,CHINN Y,et al. A ciliopathy complex at
              荧光信号很差,而在RPE1细胞中非常清晰,但是两                               the transition zone protects the cilia as a privileged mem⁃
              种细胞间不同固定方法的染色效果相似。作为间                                  brane domain[J]. Nat Cell Biol,2012,14(1):61-72
              接与轴丝相结合的蛋白,INPP5E的免疫荧光染色效                         [3] LECHTRECK K F. IFT ⁃ cargo interactions and protein
              果不仅与轴丝蛋白AC α⁃Tubulin的免疫荧光染色效                           transport in cilia[J]. Trends Biochem Sci,2015,40(12):
              果基本没有关联,甚至在纤毛转运蛋白染色中表现                                 765-778
              出众的 MeOH 固定法会几乎完全破坏 INPP5E 在纤                     [4] GOETZ S C,ANDERSON K V. The primary cilium:a sig⁃
                                                                     nalling centre during vertebrate development[J]. Nat Rev
              毛中的免疫荧光定位。
                                                                     Genet,2010,11(5):331-344
                  一些文献曾报道使用优化的固定方法,均是在
                                                                [5] REITER J F,LEROUX M R. Genes and molecular path⁃
              这 3 种方法的基础上进行改良,精力所限本研究无
                                                                     ways underpinning ciliopathies[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,
              法全部进行尝试。此外,不同实验室的实验效果也
                                                                     2017,18(9):533-547
              存在不同,例如有报道使用MeOH固定细胞后,免疫                          [6] WANG W,JACK B M,WANG H H,et al. Intraflagellar
              荧光染色显示 IFT88 聚集于纤毛两端,且在纤毛转                             transport proteins as regulators of primary cilia length[J].
              运功能受损的细胞中,IFT88 异常地聚集于纤毛底                              Front Cell Dev Biol,2021,9:661350
              部 [18] ;而另一项研究使用PFA固定细胞后的染色结                      [7] MELEPPATTU S,ZHOU H X,DAI J,et al. Mechanism of
              果显示 IFT88 沿整根纤毛分布            [19] ,前者如果使用              IFT⁃a polymerization into trains for ciliary transport[J].
              PFA固定法可能观察不到如此明显的组间差异。另                                Cell,2022,185(26):4986-4998
                                                                [8] SUN S F,FISHER R L,BOWSER S S,et al. Three⁃dimen⁃
              有报道在 TZ 蛋白 MKS1 的免疫荧光染色中特意使
                                                                     sional architecture of epithelial primary cilia[J]. Proc
              用TCA固定     [12] ,但染色效果不如其他研究使用的优
                                                                     Natl Acad Sci U S A,2019,116(19):9370-9379
              化MeOH固定法      [11,20] 。,这些差异一定程度上可能源
                                                                [9] WLOGA D,JOACHIMIAK E,LOUKA P,et al. Posttrans⁃
              于各实验室固定时的操作不同或所用抗体不同。
                                                                     lational modifications of tubulin and Cilia[J]. Cold
              总的来说,当研究纤毛定位蛋白时,可能需要多次                                 Spring Harb Perspect Biol,2017,9(6):028159
              尝试,最终根据免疫荧光实验观察的重点来选择效                            [10] EVE A. Arl13b regulates sonic hedgehog signaling from
              果最好的固定方法。                                                                         (下转第379页)
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