Page 58 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第3期
·348 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年3月
A B
MEF RPE1
PFA MeOH TCA PFA MeOH TCA
SMO SMO
GPR161 GPR161
每组3个图,左侧为共标记图像,右上为AC⁃α Tubulin标记染色,右下为相应的蛋白标记染色(×630)。
图3 不同固定方法对MEF细胞(A)和RPE1细胞(B)内SMO和GPR161的纤毛定位免疫荧光的影响
Figure 3 Effects of different fixation methods on immunofluorescence of SMO and GPR161 in proteins cilia of MEF(A)
and RPE1 cells(B)
“分别聚集在 TZ 区两侧”的形态为准,MEF 细胞和
[参考文献]
RPE1 细胞的染色效果之间也出现了差异,在一种
[1] ANVARIAN Z,MYKYTYN K,MUKHOPADHYAY S,et
细胞中可以成功染色的固定方法在另一种细胞中
al. Cellular signalling by primary cilia in development,or⁃
反而表现不佳。这种现象可能源于两种细胞蛋白
gan function and disease[J]. Nat Rev Nephrol,2019,15
表达的差异,或是源于抗体与不同种属细胞蛋白结
(4):199-219
合效果的差异。类似的是,INPP5E 在 MEF 细胞中
[2] CHIH B,LIU P,CHINN Y,et al. A ciliopathy complex at
荧光信号很差,而在RPE1细胞中非常清晰,但是两 the transition zone protects the cilia as a privileged mem⁃
种细胞间不同固定方法的染色效果相似。作为间 brane domain[J]. Nat Cell Biol,2012,14(1):61-72
接与轴丝相结合的蛋白,INPP5E的免疫荧光染色效 [3] LECHTRECK K F. IFT ⁃ cargo interactions and protein
果不仅与轴丝蛋白AC α⁃Tubulin的免疫荧光染色效 transport in cilia[J]. Trends Biochem Sci,2015,40(12):
果基本没有关联,甚至在纤毛转运蛋白染色中表现 765-778
出众的 MeOH 固定法会几乎完全破坏 INPP5E 在纤 [4] GOETZ S C,ANDERSON K V. The primary cilium:a sig⁃
nalling centre during vertebrate development[J]. Nat Rev
毛中的免疫荧光定位。
Genet,2010,11(5):331-344
一些文献曾报道使用优化的固定方法,均是在
[5] REITER J F,LEROUX M R. Genes and molecular path⁃
这 3 种方法的基础上进行改良,精力所限本研究无
ways underpinning ciliopathies[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,
法全部进行尝试。此外,不同实验室的实验效果也
2017,18(9):533-547
存在不同,例如有报道使用MeOH固定细胞后,免疫 [6] WANG W,JACK B M,WANG H H,et al. Intraflagellar
荧光染色显示 IFT88 聚集于纤毛两端,且在纤毛转 transport proteins as regulators of primary cilia length[J].
运功能受损的细胞中,IFT88 异常地聚集于纤毛底 Front Cell Dev Biol,2021,9:661350
部 [18] ;而另一项研究使用PFA固定细胞后的染色结 [7] MELEPPATTU S,ZHOU H X,DAI J,et al. Mechanism of
果显示 IFT88 沿整根纤毛分布 [19] ,前者如果使用 IFT⁃a polymerization into trains for ciliary transport[J].
PFA固定法可能观察不到如此明显的组间差异。另 Cell,2022,185(26):4986-4998
[8] SUN S F,FISHER R L,BOWSER S S,et al. Three⁃dimen⁃
有报道在 TZ 蛋白 MKS1 的免疫荧光染色中特意使
sional architecture of epithelial primary cilia[J]. Proc
用TCA固定 [12] ,但染色效果不如其他研究使用的优
Natl Acad Sci U S A,2019,116(19):9370-9379
化MeOH固定法 [11,20] 。,这些差异一定程度上可能源
[9] WLOGA D,JOACHIMIAK E,LOUKA P,et al. Posttrans⁃
于各实验室固定时的操作不同或所用抗体不同。
lational modifications of tubulin and Cilia[J]. Cold
总的来说,当研究纤毛定位蛋白时,可能需要多次 Spring Harb Perspect Biol,2017,9(6):028159
尝试,最终根据免疫荧光实验观察的重点来选择效 [10] EVE A. Arl13b regulates sonic hedgehog signaling from
果最好的固定方法。 (下转第379页)