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第43卷第3期          王伟民，赵晨卉，倪思琦，等. ZBTB3表达对胶质母细胞瘤细胞增殖和克隆形成的调控［J］.
                  2023年3月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（3）：297-303                        ·299 ·


                PCR）：通过NCBI数据库查找人ZBTB3和GAPDH基                     1.2.4 ZBTB3短发卡质粒的构建和靶点的筛选
                因 CDS 序列，并使用 Primer Premier 5 软件设计 PCR                由南京科瑞斯生物科技有限公司设计并合成
                引物，由通用生物系统有限公司合成。引物序列如                            3 个针对 ZBTB3 基因不同靶点的 shRNA 质粒，分别
                下：ZBTB3上游5′⁃CCACTGGTGGGGACCTTTTT ⁃3′，             命名为 shZBTB3⁃1、shZBTB3⁃2 和 shZBTB3⁃3，并进
                下游5′⁃AGCAGAGCCTTTCCATTCCC ⁃3′；GAPDH 上             行了 DNA 测序鉴定。靶点序列 shZBTB3⁃1：5′⁃
                游 5′⁃CAAGGTCATCCATGACAACTTTG⁃3′，下游 5′⁃            GCTTCTGGACTTTATGTATGC ⁃ 3′ ；shZBTB3 ⁃ 2：5′ ⁃
                GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG ⁃3′。提取细胞总                  GGAAACCAACTCACAGCTTCC⁃3′；shZBTB3⁃3：5′⁃

                RNA，逆转录为 cDNA，以 cDNA 为模板，用 Prime⁃                 GCATCTCAGCAGTTTCATTGG⁃3′。同时构建对照
                STAR Max DNA Polymerase 对 cDNA 进行 PCR 扩增          shRNA 质 粒（shCTR）。 将 shCTR、shZBTB3 ⁃ 1、
                     @
                反应，PCR 产物用 1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳                         shZBTB3⁃2和shZBTB3⁃3分别转染U87细胞48 h，并
               （120 V，30 min），成像观察。使用 Quantity One 软              收集 RNA 和蛋白，行 RT⁃PCR、qPCR 和 Western blot
                件对电泳条带进行灰度扫描，同时行半定量分析。                            筛选最佳沉默靶点，方法同前。
                    实时定量PCR（quantitativereal⁃time PCR，qPCR）：      1.2.5  Western blot 检测 p38MAPK、AMPK、Akt1 的

                通过 NCBI 数据库查找人 ZBTB3 和β⁃actin 基因 CDS              磷酸化水平
                序列，并使用 Primer Premier 5 软件设计 PCR 引物，                  无血清培养 U87 细胞 12 h，再用 10 μmol/L 的
                由通用生物系统有限公司合成。引物序列如下：                             SB203580、Compound C 和 Perifosine 分别处理细胞，
                ZBTB3上游5′⁃TCCTTCGTGGGGTACTATGGA⁃3′，下              收取蛋白样，用Western blot检测p38MAPK、AMPK、
                游 5′⁃CCAATTCCCGCTCCTTGTAGAA⁃3′；β⁃actin 上          Akt1的磷酸化水平，方法同前。
                游5′⁃CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG⁃3′，下游5′              1.2.6 CCK⁃8实验检测细胞的增殖水平
                ⁃AGGTCCAGACGCAGGATGGCATG ⁃3′。每个样本                     U87细胞接种于96孔板，同时转染各shRNA质
                设置 3 个复孔，反应条件：使用 ABI Step One Plus 实              粒，培养48 h，每孔替换100 μL 10%的CCK⁃8溶液，
                时定量 PCR 仪进行扩增反应。①保温阶段：95 ℃                        放置培养箱避光孵育30~50 min，酶标仪测定450 nm
                5 min；②循环阶段：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共 40 个            处的吸光度值。
                循环；③熔解曲线阶段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃               1.2.7 克隆形成实验
                15 s。实验数据处理时，以β⁃actin作为内参，计算公                         U87细胞接种于35 mm细胞培养皿中（300个/皿），
                式为2  -ΔΔCT 。                                      放置培养箱孵育 2 周，每隔 2 d 换 1 次液。弃上清
                    Western blot：将细胞裂解物煮沸后离心取上                    液，用 PBS 洗 3 次，加甲醇固定 15 min。去除甲醇，
                清，用10%预制混胶行SDS⁃PAGE电泳，先用50 V恒                     PBS洗3次，加入2 mL结晶紫染液孵育30 min，PBS洗
                压浓缩，再用 120 V 恒压电泳分离 2 h，接着用 0.3A                  3次，空气干燥。当细胞克隆直径≥0.75 mm时，记为
                湿转2 h，待蛋白转印到PVDF 膜上后，再用5%脱脂                       阳性。
                奶粉室温封闭 2 h，加入抗 ZBTB3 抗体 4 ℃孵育过                    1.3  统计学方法
                夜，1×TBST洗涤3次，每次30 min，再用HRP标记的                        采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析，使用
                二抗室温孵育 40 min，洗涤 3 次后行 ECL 化学发光                   GraphPad Prism 5.01软件进行绘图。所有实验均独
                试剂检测。使用 Quantity One 软件对电泳条带进行                    立重复3次，所得定量数据以均数±标准误（x ± sx ）进
                灰度扫描，同时行半定量分析。                                    行统计描述。多组间比较采用单因素方差分析，
                1.2.3 细胞转染                                        Bonfferoni 法进行两两比较；两组间差异比较采用 t
                    取1.5 mL EP管，加入6 μL Lipofectamine 2000和        检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
                94 μL无血清DMEM，吹打混匀，静置5 min；另取1个
                                                                  2  结 果
                1.5 mL EP管，加入2 μg质粒，再加入无血清DMEM至
                100 μL；DMEM 稀释后的 Lipofectamine 2000 加入质           2.1  GBM肿瘤组织和细胞系中ZBTB3的表达情况
                粒中，吹打混匀，静置 15 min；弃去细胞培养皿中的                           首先通过GEPIA2数据库分析GBM肿瘤组织中
                DMEM，用 PBS 清洗，加入 1.8 mL 无血清 DMEM，将                ZBTB3 的表达情况，结果显示，GBM 组织中 ZBTB3
                静置后的 Lipofectamine 2000 和质粒混合溶液缓慢                 的表达显著高于正常组织（图1A），且与患者的不良
                旋转加入细胞培养皿中。                                       预后呈正相关（图 1B）。接着选用 3 种 GBM 细胞系
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