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第43卷第4期         李 蓉，刘 露，朱夕陈，等. 洛伐他汀调节NMDA受体功能减缓NMDA兴奋性毒性损害［J］.
                  2023年4月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（04）：468⁃474                       ·469 ·


                NR2B at tyrosine（Tyr）1472 was decreased after NMDA treatment（P < 0.05），while pretreatment with LOV significantly restored the
                phosphorylation of Tyr1472（P < 0.05）. Conclusion：LOV may significantly attenuate the excitotoxicity induced by NMDA，and its
                neuroprotective effect is probably related to the selective regulation of NR2B surface expression by affecting the intracellular
                endocytosis and/or intracellular degradation of NR2B.
               ［Key words］ lovastatin；NMDA receptors；NR2B；excitotoxicity；neuroprotection
                                                                              ［J Nanjing Med Univ，2023，43（04）：468⁃474］





                    兴奋性毒性的特征是Ca 依赖的神经元细胞在                         Invitrogen 公司。
                                         2+
                过量谷氨酸（glutamate，Glu）刺激下死亡，有证据提                    1.2  方法
                示这与脑缺血和神经退行性疾病有关                 ［1-3］ 。突触Glu     1.2.1  大鼠皮质神经元的培养及处理
                过度释放会激活突触后Glu受体，导致Ca 依赖性蛋                             参照先前研究       ［13］ ，从孕 17 d 的 Sprague⁃Dawley
                                                    2+
                白酶钙蛋白酶过度活化，促进关键细胞骨架和膜蛋                            大鼠胚胎中分离出皮质神经元。细胞培养 2 周待
                白的降解 。尽管几乎所有 Glu 受体亚型都参与介                         NMDA受体发育成熟后使用。将发育成熟的原代神
                        ［4］
                导兴奋性毒性信号转导，但普遍认为 N⁃甲基⁃D⁃天                         经 元 细 胞 分 未 处 理（vehicle）组 、LOV 组 、NMDA
                冬氨酸（N⁃methyl⁃D⁃aspartate，NMDA）受体由于其高              组、LOV+NMDA 组、Glu 组及 Glu+APV 组。未处理
                钙渗透性而发挥主要作用 。其中NR1为最基本的                           组不做特殊处理；LOV 组用 LOV 500 nmol/L 预处
                                       ［3］
                功能单位，NR2 为重要的调节亚单位。含 NR2A 的                       理大鼠皮质神经元 3 d ；NMDA 组和 Glu 组分别应
                NMDA 受体通常与细胞存活有关，而 NR2B 型突触                       用 100 μmol/L NMDA 和100 μmol/L Glu 处理培养的
                外受体与细胞死亡信号有关 。有研究报道，兴奋                            神经元 15 min；NMDA+LOV 组在 NMDA 处理之前，
                                         ［5］
                毒性谷氨酸能神经元中 NR2B 表达和调控受钙蛋                          用LOV 500 nmol/L预处理大鼠皮质神经元3 d，以观
                白酶（calpain）和细胞周期素依赖性激酶 5（cyclin                   测LOV对这些应激是否有保护作用；Glu+APV组在
                                       ［6-7］
                dependent kinase 5，CDK5）  调节。他汀类药物是               Glu 处理神经元之前 30 min，应用 NMDA 受体特异
                最为常用的降胆固醇药物，越来越多的研究支持他                            性的拮抗剂100 μmol/L APV预处理。
                汀对卒中事件和神经退行性疾病的保护作用                      ［8-11］ 。  1.2.2  免疫荧光染色
                我们先前研究表明，洛伐他汀（lovastatin，LOV）能                        各组经过处理的标本用 4％多聚甲醛固定
                抑制 calpain 和 CDK5 的过度激活而发挥神经保护                    20 min 后，加入含有 0.2％Triton X⁃100/PBS 5 min，
                作用  ［12］ ，然而，这其中的确切机制仍需进一步研                       PBS 清洗后，滴加血清封闭液，室温封闭 1 h。使用
                究。本研究在培养的大鼠原代神经元中检测 LOV                           鼠抗 MAP⁃2（1∶500）4 ℃孵育过夜。Alexa⁃594 结合
                对 NMDA 诱导的兴奋性毒性的保护作用，并探讨                          的羊抗鼠 IgG（1∶500）室温孵育 1 h 后 DAPI 复染。
                LOV在兴奋性毒性信号转导中的潜在保护机制。                            在荧光显微镜下观察，并对每个MAP⁃2阳性神经元
                                                                  突起的数量及突起的长度进行定量分析。
                1 材料和方法
                                                                  1.2.3  TUNEL分析
                1.1  材料                                               参照原位细胞死亡检测试剂盒的方法行TUNEL
                    LOV、Glu、NMDA、APV（特异性NMDA受体拮抗                  染色，随后细胞用 DAPI（1 μg/mL）复染 5 min。荧

                剂）、环己酰胺（cyclohexamide，CHX）购自美国Sigma               光封片剂封片后，于荧光显微镜下观察，并计数
                公司，蛋白酶抑制剂（cocktail of protease inhibitors）        TUNEL 阳性细胞，计算 TUNEL 阳性细胞率。对每

                和原位细胞死亡检测试剂盒TUNEL 购自瑞士Roche                       组3~4次独立实验的6~8个盖玻片观察计数。
                公 司 ，Sulfo⁃NHS⁃LC⁃biotin［sulfosuccinimydyl⁃6⁃     1.2.4  蛋白免疫印迹（Western blot）
               （biotinamido）⁃hexanoate］和抗生蛋白链菌素（strep⁃                按照文献所述制备蛋白及进行蛋白免疫印迹
                tavidin）购 自 美 国 Pierce 公 司 ，抗 微 管 相 关 蛋 白         检测  ［14］ 。大鼠皮质神经元经过处理后，弃培养液，

               （microtubule⁃associated protein 2，MAP⁃2）和 4′，6′⁃   冷 PBS 洗两遍，加入预冷的细胞裂解液（10 mmol/L
                diamidino⁃2⁃phenylindole（DAPI）购自美国 Chemicon       Tris，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，
                公 司 。 Alexa⁃594 结 合 的 羊 抗 鼠 IgG 购 自 美 国           5 mmol/L EGTA，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4，
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