Page 32 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第4期
               ·470 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年4月


              5 mmol/L DTT，1% NP⁃40 及蛋白酶抑制剂）作用                  观察LOV对NR2B稳定性的影响。
              20 min，离心取上清蛋白。蛋白浓度的测定采用                          1.3  统计学方法
              Lowry 法。取等量样品（20 μg），以4%~20% SDS⁃聚                     数据分析使用 SPSS 18.0 统计软件进行，数据
              丙烯酰胺预制凝胶进行电泳分离蛋白。电泳结束                             使用均数 ± 标准差（x ± s）表示，采用 Student’s t 检
              后将蛋白转至 PVDF 膜（300 mA，90 min），用含 5%                验对数据进行统计比较，P < 0.05 为差异有统计学
              脱脂奶粉的 PBST 封闭 60 min，加入一抗 4 ℃过夜。                  意义。
              一抗具体为：β⁃actin（1∶5 000，Sigma 公司，美国），
                                                                2 结     果
              NR2B（1∶400）、NR1（1∶1 000）、GluR2（1∶1 000）、

              phosphor⁃NR2B（Tyr1472，1∶500）、phosphor⁃NR2B        2.1  LOV对神经元兴奋毒性的保护作用
             （Tyr1336）（1∶1 000，Millipore 公司，美国）。一抗孵                  本课题组之前的研究显示，LOV在低浓度（0.5~
              育后，PBST 洗涤，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或                         1.0 μmol/L）下对 NMDA 具有最佳的神经保护作
              鼠IgG二抗（1∶5 000 稀释）孵育1 h，PBST洗涤，此后                 用 ［12-14］ 。本研究用0.5 μmol/L LOV对原代培养的神
              按ECL显色试剂盒说明书操作，曝光后在激光光密                           经元进行预处理 3 d，以研究 LOV 的兴奋毒性保护
              度图像扫描系统进行光密度分析。以β⁃actin 为内                        作用和潜在的机制。MAP⁃2 是一种神经元特异
              参照，实验重复3 次以上。                                     性细胞骨架蛋白，对 MAP⁃2 的免疫荧光染色显示
              1.2.5  生物素化法检测细胞表面受体                              （图 1A~C），与未处理组相比，NMDA 组或 Glu 组

                  生物素化法检测细胞表面受体参照 Hawasli                       MAP⁃2阳性神经元显著减少，少数幸存神经元的染
              等 ［15］ 的研究方法。培养的大鼠皮质神经元用冷                         色多集中在胞体，树突的数目和长度均明显减少。
              PBS 洗 2 遍后，加入预冷的含 0.5 mg/mL Sulfo⁃NHS⁃            与 NMDA 组相比，在 NMDA 处理前加用 LOV 预处
              LC⁃biotin 的 PBS，4 ℃孵育 20 min。冷 PBS 洗 3 遍          理，其 MAP⁃2 免疫阳性神经元的数量明显增多，且
              后，加入细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂、0.1% SDS、                       神经元树突的数目和长度均明显增加（P < 0.001）。
              1% Triton X⁃100 的 PBS）作用 30 min，用细胞刮刮             与Glu组相比，在Glu处理前使用NMDA受体特异性
              下细胞，冰上放置 30 min，4 ℃、14 000 r/min 离心               拮抗剂APV预处理，其MAP⁃2免疫阳性神经元的数
              10 min，取上清蛋白。蛋白浓度的测定采用 Lowry                      量明显增多，神经元树突的数目和长度均明显增加
              法。取等量样品（500 μg），加入 streptavidin 4 ℃ 孵             （P < 0.001）。TUNEL 染色的结果进一步支持 LOV
              育过夜。免疫沉淀物溶于1×上样缓冲液中，通过蛋                           的神经保护作用。TUNEL 染色显示（图 2A~B），
              白免疫印迹法测定其蛋白水平。                                    未处理组凋亡细胞很少，NMDA 组或 Glu 组 TUNEL
                  应用蛋白合成抑制剂环己酰胺抑制NR2B的合                         阳性细胞显著增多，在 NMDA 或 Glu 处理前加用
              成，以观察 NR2B 的降解情况。在 100 μmol/L 环己                  LOV 或 APV 预处理，能显著减少 TUNEL 阳性细
              酰胺加入培养液后不同时间点（0、30、60 min），收集                     胞（P < 0.001），提示 LOV 显著减少神经元细胞的
              各组细胞，蛋白定量后Western blot检测NR2B，动态                   凋亡。


               A     Vehicle    NMDA        Glu      B                             C
                                                           1.2                           7
                                                           1.0        ***   ***          6 5
                                                          树突相对长度  0.8                  树突数量  4 3   ***   ***

                                                           0.6

                      LOV     LOV+NMDA    APV+Glu          0.4                           2
                                                           0.2                           1
                                                            0                            0
                                                                                                LOV+NMDA
                                                                   LOV+NMDA
                                                            Vehicle  LOV NMDA  Glu APV+Glu  Vehicle  LOV NMDA  Glu APV+Glu


                           A：各组MAP⁃2免疫荧光染色结果；B、C：各组树突长度和数量的定量比较；两组比较， P < 0.001（n=3）。
                                                                                     ***
                                                 图1 MAP⁃2染色检测神经元形态
                                       Figure 1  Neuronal morphology assay with MAP⁃2 staining
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