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第43卷第4期          朱德明，孔连宝，贾文博，等. ANKRD1通过介导上皮细胞间充质转化促进肝细胞肝癌增殖
                  2023年4月                 与转移［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（04）：484⁃491                   ·485 ·


                    肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是          ANKRD1的干扰RNA（siRNA）的慢病毒均购自上海
                原发性肝癌的主要组织学亚型，占世界范围内原发                            GenePharma公司。按照试剂盒说明书将慢病毒感
                性肝癌病例数的80%。在全球癌症统计中，肝癌新                           染细胞，并使用嘌呤霉素孵育 2 周以建立稳定的
                发病率排名第七，死亡率排名第二 。肝细胞肝癌                            细胞克隆。
                                               ［1］
                发展的诱因包括慢性改变的肝脏微环境或由肝硬                             1.2.2  RT⁃qPCR
                化引起的遗传和表观遗传改变               ［2-3］ 。尽管肝癌的预             采用TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国）提取肝
                防、诊断和干预已得到改善，但由于 HCC 患者缺乏                         癌组织和细胞株总 RNA。这些总 RNA 用分光光度

                早期症状，以及 HCC 高增殖及高转移的特性，HCC                        计 法（NanoDrop technologies 公 司 ，美 国）进 行 定
                患者的总体诊疗结果仍不乐观。因此，需要进一步                            量。逆转录采用 Prime Script RT 试剂盒（大连宝生
                研究HCC发病的分子机制。                                     物公司）。在 ABI 7900 PCR 系统（ABI 公司，美国）
                    ANKRD1，也被称为心脏锚蛋白重复蛋白或心脏                       中使用 SYBR Premix ExTaqⅡ（大连宝生物公司）
                阿霉素应答蛋白，是人类 ANKRD1 基因（10q23.31）                   进行实时定量 PCR。根据 2          -ΔΔCT  方法计算相对表达
                                                                    ［9］
                编码的蛋白。它主要表达于心脏和骨骼肌，在特发                            量 。
                性扩张型心肌病或心力衰竭时表达增加                   ［4-5］ 。对于     1.2.3  细胞增殖实验（CCK⁃8法）
                                                                                              3
                癌症的进展，ANKRD1 被证明是肿瘤抑制因子 p53                           将细胞置于 96 孔板（1×10 个/孔）中培养，待测
                的共激活因子 ，ANKRD1 的过表达也与顺铂耐药                         细胞中每孔加入 10 μL CCK⁃8 溶液，培养 2 h，用酶
                            ［6］
                                     ［7］
                和卵巢癌预后恶化相关 。此外，ANKRD1 在非小                         标仪（Thermo Scientific公司，美国）测定450 nm处的
                细胞肺癌中与上皮细胞⁃间充质转化（epithelial⁃mes⁃                  吸光度。每天检测1次，连续检测5 d。
                enchymal transition，EMT）通路和抗凋亡有关 。但               1.2.4  平板克隆实验
                                                        ［8］
                目前ANKRD1在肝癌中的作用尚未见报道。                                 500个细胞均匀铺在6孔板中孵育2周，然后用
                    本研究通过实时定量 PCR 技术发现 ANKRD1                     4%多聚甲醛固定细胞，用结晶紫染色液染色，计数
                在肝癌组织中高表达。ANKRD1 可以促进肝癌细                          细胞团并统计。
                胞系增殖、迁移与侵袭，同时，进一步发现 ANKRD1                        1.2.5  划痕实验
                可以介导 HCC 细胞 EMT 通路激活。综上所述，                            细胞置于 6 孔板中培养。当细胞密度达 90%
                ANKRD1 是一个促癌基因，并可能成为肝细胞肝癌                         时，用 200 μL 塑料吸管头在细胞表面划线。用倒
                治疗的潜在靶点。                                          置显微镜（Olympus 公司，日本）在不同时间点（0 h
                                                                  和48 h）拍摄划痕，并记录细胞迁移情况。
                1 材料和方法
                                                                  1.2.6  Transwell实验
                1.1  材料                                               使用 Transwell 小室（8 μm 孔径，Corning 公司，
                    人 肝 癌 细 胞 系（Huh7、SMMC7721、HepG2、              美国）检测迁移和入侵能力。在细胞迁移实验中，将
                Hep3B、HCCLM3、Focus 和 YY8103）以及永生化人                2×10 个细胞重悬于200 μL无血清DMEM中并放入
                                                                      4
                肝细胞 LO2 从中国科学院上海细胞生物学研究所                          上室，将 600 μL 含 10%胎牛血清 DMEM 放入下室。
                获得。                                               细胞侵袭实验用 50 μL Matrigel 胶（BD Biosciences
                    肝癌组织和癌旁组织标本来自南京医科大学                           公司，美国）铺板，细胞在5% CO2、37 ℃下培养48 h，
                第一附属医院肝胆中心肝切除术患者。病理检查                             用棉签擦去上室细胞。下室细胞用中性福尔马林
                证实为肝细胞癌组织，取出后利用液氮立即保存。                            固定 30 min，1%结晶紫染色。用显微镜在小室左
                本研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会                             上、左下、右上、右下以及中间 5 个视野进行拍照。
                批准，所有患者均签订知情同意书。                                  实验独立重复3次以上。
                1.2  方法                                           1.2.7  细胞增殖实验（EdU法）
                1.2.1  细胞培养和转染                                        采用 EdU（广州 RiboBio 公司）检测 ANKRD1 对
                    所有细胞均在 37 ℃，5% CO2 条件下，在含有                    细胞增殖的作用。细胞均匀铺在24孔板中，EdU孵
                10%胎牛血清（Gibco 公司，美国）、50 U/mL 青霉素                  育2 h，PBS洗涤5 min后中性福尔马林固定细胞，用
                链霉素（Invitrogen 公司，美国）的 DMEM 培养基中                  2 mg/mL甘氨酸中和甲醛，加入0.5% Triton X⁃100在
                培 养 。 过 表 达 ANKRD1 的 慢 病 毒 、包 埋 针 对               摇床上摇动 20 min。然后按照实验室规程进行
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