Page 48 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第4期
·486 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年4月

DAPI 染色和 Apollo 染色。使用荧光显微镜观察并 表1 ANKRD1表达与肝癌临床病理特征的关系
拍照。 Table 1 Association between ANKRD1 expression and
1.2.8 Western blot clinical features of HCC （n）
使用RIPA裂解组织和细胞，4 ℃高速离心获取 ADKRD1表达
临床参数 例数 高表达 低表达 P值
蛋白原液，加入上样缓冲液并煮沸10 min，-20 ℃保
（n=25） （n=25）
存备用。采用 SDS⁃PAGE 凝胶电泳分离蛋白质。
年龄 0.232
然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene >60岁 33 14 19
fluoride，PVDF）膜上（Bio⁃Rad 公司，美国）。PVDF ≤60岁 17 11 6
膜与特异性一抗在4 ℃孵育过夜。PVDF膜洗涤3次 性别 0.393
后，37 ℃二抗孵育2 h，用Super ECL检测试剂（上海 女 22 13 9
翌圣生物科技有限公司）使蛋白条带显影。 男 28 12 16
1.2.9 小鼠皮下成瘤实验 HBV 0.377
所有动物实验均经南京医科大学动物管理 阴性 32 18 14
阳性 18 7 11
和伦理委员会批准，40 只雄性 BALB/c 裸鼠购自
肿瘤数量 0.019
南京医科大学动物研究中心。5 × 10 个转染后的
6
单发 31 11 20
肝癌细胞系被注射到裸鼠的侧腹。每 3 d 记录 1 次
多发 19 14 5
2
肿瘤大小，4 周后处死小鼠。肿瘤体积按长 × 宽 /2 肿瘤大小 0.032
计算。 ≤5 cm 34 13 21
1.3 统计学方法 > 5 cm 16 12 4
采用 SPSS 18.0 和 GraphPad Prism 7.0 软件进行 AFP 0.567
统计分析。定量数据以均数±标准差（x ± s）表示。 ≤200 ng/mL 29 13 16
两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用方差分 > 200 ng/mL 21 12 9
TNM 分期 0.377
析。P < 0.05为差异有统计学意义。
Ⅰ 32 14 18
2 结 果 Ⅱ~Ⅲ 18 11 7
微血管浸润 < 0.001
2.1 ANKRD1 在肝癌组织及肝癌细胞系中表达均 是 19 3 16
上调 否 31 22 9
TCGA 上的数据显示，ANKRD1 在肝癌组织中
表达上调（图1A）。对50对肝癌/癌旁组织进行实时 系，Western blot 实验验证了过表达效率（图 2A）。
定量PCR，分析ANKRD1的相对表达情况，结果显示， CCK⁃8 和 EdU 实验结果表明，过表达 ANKRD1 的细
ANKRD１在肝癌组织中表达量较癌旁组织中上调 胞增殖能力明显增强（图 2B、D），平板克隆实验也
（图 1B）。Western blot 实验进一步证实了 ANKRD1 表明过表达 ANKRD1 的细胞生成的细胞团数量更
在肝癌组织中表达上调（图 1C）。进一步在肝癌细 多（图 2C）。划痕实验表明，与对照组相比，过表
胞系以及永生化肝细胞系 LO2 中检测 ANKRD1 的 达 ANKRD1 细胞的移动能力更强（图 2E），同时，
mRNA以及蛋白表达差异，结果发现与LO2相比，肝 Transwell 实验也表明过表达 ANKRD1 可以增强肝
癌细胞系中 ANKRD1 的表达也普遍上调（图 1D、 癌细胞的迁移及侵袭能力（图2F）。
E）。临床病理数据分析显示，ANKRD1与HCC肿瘤 2.3 敲低 ANKRD1 可以抑制肝癌细胞的增殖与迁
大小、数量、微血管浸润呈正相关（表1）。生存分析 移能力
显示 ANKRD1 高表达患者总生存期较低表达患者 使用基于慢病毒的小干扰 RNA 来敲低肝癌细
缩短（图1F）。 胞系 Focus 的 ANKRD1 表达量，其敲低效率通过
2.2 过表达ANKRD1促进肝癌细胞增殖、迁移与侵 Western blot实验来验证（图3A），结果表明si⁃2的敲
袭能力 低效率最显著并用于后续的实验研究。细胞功能
通过向 Hep3B 细胞系感染携带 ANKRD1 过表 实验结果表明，与对照组相比，敲低ANKRD1后，肝
达质粒的慢病毒来构建 ANKRD1 稳定过表达细胞 癌细胞的增殖能力明显减弱（图 3B~D），肝癌细胞