Page 104 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第5期
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              39 mmol/L 柠檬酸和 135 mmol/L 葡糖糖，pH 6.5）对            烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）电泳，将
              PRP 进行 3 倍稀释，同时加入 0.1 U/mL 的三磷酸腺                  蛋白转到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）后，用5%的脱脂奶
              苷双磷酸酶，防止血小板在离心过程中发生活化，                            粉溶液封闭1.5 h，TBST洗膜3次后于4 ℃避光孵育一
              对血小板PRP进行离心（22 ℃、800 g、10 min），弃上                 抗 phospho⁃Src（1∶1 000）、phospho⁃Syk（1∶1 000）和
              清后用台式缓冲液（137 mmol/L 氯化钠、12 mmol/L                 GAPDH（1∶10 000）过夜，洗膜后室温避光孵育二抗
              碳酸氢钠、2 mmol/L 氯化钾、0.34 mmol/L 磷酸氢二                羊抗兔（1∶20 000）1.5 h，最后用自动化学发光图像
              钠、1 mmol/L氯化镁、5.5 mmol/L葡萄糖、5 mmol/L乙             分析系统对条带进行曝光，以检测血小板 Src、Syk
              磺酸，pH 7.4）重悬血小板，可得到纯化血小板（血小                       的磷酸化水平。条带灰度用 Quantity One 分析软件
              板纯度>98%），置于 37 ℃恒温箱中备用              ［24-25］ 。以下   进行分析     ［8，22-23］ 。实验重复3次，每次实验的样本均
              实验中的样本均来自单独志愿者的纯化血小板。                             来自独立的志愿者。
              1.2.3 流式细胞术检测血小板表面CD62P的表达                        1.3  统计学方法
                  用不同浓度的SFN（1.0、2.5、5.0 μmol/L）或溶剂                   采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，多组间
              对照（0.05%DMSO）与纯化血小板（5×10 个/mL）孵                   比较采用单因素方差分析，差异显著后采用 Tukey
                                                   6
              育 40 min 后，用 50 μg/mL 的 ox⁃LDL 刺激血小板              法进行组间两两比较，双侧 P < 0.05 为差异有统计
              20 min，然后加入 FITC 偶联的 CD62P 抗体，避光孵                 学意义。实验数据用平均值±标准误（x ± sx ）表示，
              育 20 min 后用 1%的多聚甲醛固定，最后用流式细                      统计数据至少来自3个独立的志愿者样本。
                                           ［8］
              胞仪检测血小板 CD62P 的表达 。SFN 和 ox⁃LDL
                                                                2  结 果
              干预浓度和干预时间的选择依据已发表文献                     ［6，20］ 。
              1.2.4 血小板PF4和CCL5释放水平的测定                          2.1  SFN对ox⁃LDL诱导的血小板活化的影响
                  分别用不同浓度的SFN（1.0、2.5、5.0 μmol/L）或                   通过检测血小板表面 CD62P 的表达和 PF4 与
              溶剂对照以及 ox⁃LDL（50 μg/mL）处理纯化血小板                    CCL5 的释放水平来评价 SFN 对血小板活化的影
             （1×10 个/mL）后，在 4 ℃、12 000 g 的条件下离心                 响。流式细胞术结果表明，与对照组相比，仅高浓度
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              5 min，弃沉淀，用酶联免疫吸附法测定上清液中                          的 SFN（5.0 μmol/L）可显著降低 ox⁃LDL 诱导的血小
              PF4和CCL5水平，具体方法参照制造商提供的说明                         板表面 CD62P 的表达水平，差异具有统计学意义
              书。当探讨Src/Syk/ROS信号通路在SFN调控PF4和                    （P < 0.01，图 1A）；而更低浓度的 SFN（1.0 μmol/L 和
              CCL5 释放中的作用时，Src 家族激酶抑制剂 PP2                      2.5 μmol/L）虽有抑制 CD62P 表达的趋势，但是与对
             （20 μmol/L）或激动剂MLR⁃1023（1 μmol/L）与血小板              照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）；此外，各浓
              预孵育20 min，然后加入 SFN（5 μmol/L）和血小板                  度 SFN 间的比较结果发现，5.0 μmol/L 浓度的抑制
              继续孵育 40 min，ox⁃LDL 激活血小板 20 min 后进                作用要比 1.0 μmol/L 的更为显著（P < 0.05，图 1A）。
              行PF4和CCL5释放水平的测定。                                 同时，酶联免疫吸附实验结果表明，与对照组相比，
              1.2.5 血小板总ROS生成水平的测定                              2.5 μmol/L 和 5.0 μmol/L 浓度的 SFN 均可显著抑制
                  分别用不同浓度的 SFN（1.0、2.5、5.0 μmol/L）              ox⁃LDL诱导的血小板PF4和CCL5的释放（P < 0.05，
              或溶剂对照以及 ox⁃LDL（50 μg/mL）处理纯化血小                    图 1B、C）；相对于 1.0 μmol/L 浓度，2.5 μmol/L 和
              板（1×10 个/mL）后，在各组血小板悬液中加入                         5.0 μmol/L浓度的SFN作用更加显著（P < 0.05）。以
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              20 μmol/L 荧光探针 DCFH⁃DA，避光孵育 20 min，               上结果说明，SFN可抑制ox⁃LDL诱导的血小板活化。
              离心（12 000 g、4 ℃、5 min）后用酶标仪在发射波长                  2.2  SFN对ox⁃LDL诱导的血小板Src/Syk/ROS信号
              525 nm和激发波长490 nm的条件下读取荧光值，用                      通路活化的影响
                                       ［22］
              来反映血小板内总ROS水平 。                                        已有研究证实，Src/Syk/ROS信号通路在ox⁃LDL
                                                                                                  ［6］
              1.2.6 Western blot蛋白免疫印迹分析                        诱导血小板活化过程中发挥重要作用 。与对照组
                  健康人纯化血小板（2.5×10 个/mL）经不同浓度                    相比，2.5 μmol/L和5.0 μmol/L的SFN均可显著下调
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              的SFN（1.0、2.5、5.0 μmol/L）和ox⁃LDL（50 μg/mL）处        ox⁃LDL 诱导的血小板 Src（Tyr ）和 Syk（Tyr ）发生
                                                                                                       323
                                                                                           416
              理后，在4 ℃、12 000 g的条件下离心10 min，弃上清                  磷酸化和ROS生成，差异具有统计学意义（P < 0.05，
              得到血小板沉淀，对血小板进行裂解后，常规提取                            图2A~C），然而更低浓度的SFN（1.0 μmol/L）干预后
              血小板蛋白，经蛋白浓度测定后，对样本进行十二                            无显著效果（P > 0.05）。2.5 μmol/L 和5.0 μmol/L 浓
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