Page 23 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第5期 付 鑫，吴 茗，陈 献，等. mTOR信号通路在调控卵巢癌CD4 Treg糖代谢中的作用［J］.
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2023年5月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（5）：604-610 ·605 ·

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mTOR signal of CD4 Treg in SKOV3 growth environment，the glucose uptake（193.49 ± 13.28 vs. 174.05 ± 14.58，P < 0.01）and
glycolysis level（21.97±0.87 vs. 4.85±1.54，P < 0.001）were decreased significantly. Glucose metabolism⁃related genes and proteins
were also significantly reduced. Conclusion：mTOR and its downstream signaling pathway are significantly activated in peripheral
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blood CD4 Treg of ovarian cancer patients，and mTOR signaling pathway can affect glucose metabolism of CD4 Treg by regulating
glucose metabolist⁃related genes and protein levels.
［Key words］ ovarian cancer；regulatory T cell；mTOR signaling；glucose metabolism
［J Nanjing Med Univ，2023，43（05）：604⁃610］

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是严重威胁女性 外周血标本各 10 例。病例入组标准：临床诊断明
健康的恶性肿瘤，其死亡率居生殖系统恶性肿瘤 确、未经任何治疗的初诊患者，无其他重大传染病
前列 ，由于其发病隐匿，发展迅速，容易在盆腹腔 史，不伴其他严重疾病，并排除糖尿病患者。本研
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脏器广泛转移，多数卵巢癌患者初诊时已为晚期， 究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准
预后极差。目前卵巢癌的基本治疗方案仍是根治 （伦审号：2017⁃SRFA⁃064）。
性手术联合辅助性化疗，但卵巢癌化疗易耐药且易 健康对照外周血由健康志愿者提供。人卵巢
复发，治疗效果不甚理想 ，迫切需要新的有效治疗 浆液性囊腺癌细胞株 SKOV3 来源自中科院上海细
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策略。免疫治疗有望成为最有希望的一种新型治 胞库。
疗方案，CD4 调节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg） 淋巴细胞分离液Ficoll（天津灏洋生物制品有限
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介导的肿瘤微环境中的免疫抑制是肿瘤免疫治疗的 公司）；鼠抗人CD4、鼠抗人CD25、鼠抗人 CD127、鼠
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关键障碍 。研究发现，T细胞在肿瘤微环境中被激 抗人 mTOR 抗体（BD 公司，德国）；CD3/CD28 T 细胞
活后其代谢方式发生改变，而不同的代谢方式又会影 扩增磁珠（Invivogen 公司，美国）；PCR 引物（南京金
响T细胞的分化和功能发挥。肿瘤微环境中的“War⁃ 斯瑞生物科技有限公司）；RNeasy Micro Kit（Qiagen
burg 效应”也与抑制性T细胞的产生相关，从而促进 公司，美国）；KRPH缓冲液（北京雷根生物技术有限
肿瘤免疫逃逸 。全面了解Treg的代谢特征以及控 公司）；Prime Script RT reagent Kit（TaKa Ra 公司，日
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制代谢的关键调控分子对控制或逆转肿瘤免疫抑制 本）；糖摄取分析试剂盒（Biovision公司，美国）；兔抗
微环境至关重要。本课题组前期研究表明，在卵巢癌 人 GAPDH 单克隆抗体（上海碧云天生物技术有限
细胞SKOV3的生长环境中，CD4 T细胞中Foxp3 阳性 公司）；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（大连宝生物工程
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TM
细胞比例上升，糖代谢水平增强 ［5-6］ ，而其中介导糖代 有限公司）；兔抗人 p⁃mTOR 单克隆抗体、兔抗人
谢水平改变的关键调控分子有待研究。 p⁃P70S6K 单克隆抗体、兔抗人 p⁃4E⁃BP1 单克隆抗
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of 体、兔抗人LDH⁃α单克隆抗体、兔抗人Glut1单克隆
rapamycin，mTOR）是一种关键的调节细胞生存、代 抗体、兔抗人PKM2单克隆抗体、兔抗人GPI单克隆
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谢和免疫的蛋白激酶 ，作为细胞内非常重要的信 抗体、兔抗人 HIF⁃1α单克隆抗体（Cell Signaling 公
号转导通路，其在调控卵巢癌CD4 Treg糖代谢中的 司，美国）；糖酵解分析试剂盒（Cayman公司，美国）。
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作用尚未有报道。本研究从卵巢癌患者外周血 1.2 方法
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CD4 Treg 中 mTOR 信号活化情况入手，探究 mTOR 1.2.1 流式检测外周血中mTOR CD4 Treg百分比
信号在调控CD4 Treg的糖代谢中的作用，为寻找卵 使用Ficoll 液密度梯度离心法分离外周血单个
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巢癌新的免疫治疗靶点提供思路。 核细胞，于流式管中加入一定浓度的抗体如下：鼠
抗 人 CD4、鼠 抗 人 CD25、鼠 抗 人 CD127、鼠 抗 人
1 对象和方法
mTOR 抗体，经孵育、洗涤后使用 BD FACS Calibur
1.1 对象 流式细胞仪检测。
收集2020年6月—2021年1月就诊于南京医科 1.2.2 流式分选和扩增CD4 Treg细胞
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大学第一附属医院和南京市妇幼保健院的卵巢癌 抽取健康志愿者外周血50 mL，Ficoll 液分离外

患者（OC）、卵巢良性肿瘤患者（ovarian benign tumor 周血单个核细胞，无菌条件下加入以下抗体：鼠抗
patients，BOT）和健康志愿者（healthy controls，HC） 人 CD4、鼠 抗 人 CD25、鼠 抗 人 CD127，室 温 孵 育