Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第5期
·606 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年5月

20 min，全程注意避光操作，最后用 PBS 清洗 2 次， RNA 浓度为 500 ng/mL，采用 Prime Script RT reagent
并进行流式分选（BD FACS AriaⅡ），收集分选的细 Kit 试剂盒，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s 条件下进行 RNA
胞铺入圆底96孔板中，并加入Treg细胞扩增磁珠进 逆转录，荧光定量 PCR 用于检测 mTOR 信号通路相
行细胞培养。 关 AKT、Rheb、mTOR、HIF ⁃ 1α、4E ⁃ BP1、TSC2、
1.2.3 SKOV3细胞与CD4 Tregs共培养体系的建立 P70S6K 基因、糖代谢相关 TPI、PKM2、Glut3、ENO1、
+
体系最终体积1.5 mL/孔，在Transwell板的下室 Glut1、LDH⁃α、GPI 基因的 mRNA 表达水平，扩增程
5
5
加入2×10 个SKOV3细胞，在上室加入8×10 个CD4 + 序：按 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒推荐程序。
Tregs，37 ℃、5%CO2培养箱培养72 h后，收集共培养 引物序列见表1。
前、后各组的CD4 Treg细胞，用于后续实验。 1.2.5 细胞总蛋白提取和Western blot
+
+
1.2.4 荧光定量PCR 收集各组 CD4 Tregs，蛋白裂解液用于提取细
+
各处理组CD4 Treg细胞分别收集，使用RNeasy 胞总蛋白，测定浓度后加入5×蛋白上样缓冲液进行
Micro Kit 试剂盒按说明书步骤提取总 RNA，并调整 稀释，金属浴加热煮沸，-20 ℃保存。随后使用10%

表1 引物序列一览表
Table 1 PCR primer sequences

基因 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′）
β⁃actin GAGCTACGAGCTGCCTGACG GTAGTTTCGTGGATGCCACAG
AKT CTGAGATTGTGTCAGCCCTGGA CACAGCCCGAAGTCTGTGATCTTA
TSC2 ATAGCTGTTACCTCGACGAGT TGCAGGGAGACCTCTATGTCC
mTOR ATGCTTGGAACCGGACCTG TCTTGACTCATCTCTCGGAGTT
P70S6KP70 AGAACTTCTGGCTCGAAAGGT CGACAGGTGTCTGACGTGTAA
4E⁃BP1 CTATGACCGGAAATTCCTGATGG CCCGCTTATCTTCTGGGCTA
Rheb AGGGTCATGACGCAGCGAGT TGCGTCGGGGCGACGTTTTA
Glut3 GCTCTCTGGGATCAATGCTGTGT CTTCTTGCCCTTTCCACCAGA
HIF⁃1α CCATTAGAAAGCAGTTCCGC TGGGTAGGAGATGGAGATGC
Glut1 TTGGCTCCGGTATCGTCAAC GCCAGGACCCACTTCAAAGA
GPI AGGCTGCTGCCACATAAGGT AGCGTCGTGAGAGGTCACTTG
ENO1 TCATCAATGGCGGTTCTCA TTCCCAATAGCAGTCTTCAGC
PKM3 GCCGCCTGGACATTGACTC CCATGAGAGAAATTCAGCCGAG
LDH⁃α CCAGCGTAACGTGAACATCTT CCCATTAGGTAACGGAATCG
TPI AGGCATGTCTTTGGGGAGTC AGTCCTTCACGTTATCTGCGA

分离胶进行 Western blot 电泳，浓缩胶用 80 V 电泳， 葡萄糖（2⁃DG）10 μL/孔，孵育20 min，按说明书充分
至蛋白压缩至分离胶且 marker 分散后将电压调整 反应后检测412 nm波长的吸光度值，每10 min检测
为 100 V。待电泳结束，以 100 mA 转膜 1 h 50 min， 1 次，糖摄取水平为吸光度值根据标准曲线将细胞
载有蛋白的PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液、室温摇晃 摄取葡萄糖类似物2⁃DG的含量换算得到。
下封闭 3 h 后，放入一抗中 4 ℃孵育过夜，次日 1× 1.2.7 糖酵解水平测定
TBST 洗膜 3 次后，加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二 收集各组 CD4 Treg 细胞，PBS 洗涤后，于 96 孔
+
抗室温孵育 2 h，1×TBST 再次洗膜 3 次，PVDF 膜表 板中加入细胞3×10 个/孔，加入RPMI 1640培养基补
5
面均匀加入发光试剂后曝光成像。 足体积为200 μL/孔，培养箱中培养24 h后离心收集
1.2.6 糖摄取实验 上清液，比色法检测上清液中L⁃乳酸的含量，再根据
收集各组 CD4 Tregs 细胞，PBS 清洗计数，加入 标准曲线转化为糖酵解水平。
+
3×10 个/孔细胞于平底 96 孔板中，每孔用无血清培 1.3 统计学方法
5
养基补足体积至 100 μL，饥饿细胞过夜，第 2 天用 所有数据使用 SPSS 25.0 统计学软件进行数据
PBS 洗 涤 细 胞 后 ，加 入 2%BSA 的 KRPH 缓 冲 液 分析，同时使用 Image Lab 软件提取 Western blot 图
100 μL/孔，预孵育40 min后，加入10 mmol/L 2⁃脱氧 像的数据。各组数据均以均值±标准差（x ± s）表示，