Page 82 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第5期
               ·664 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年5月


              24 周的小鼠左室壁厚度持续增加，心脏体积明显增                          1.2.2 小肠上皮组织外泌体的提取制备
                                        ［3］
              大，并出现心室舒张功能下降 。                                        将 HFD 及正常饮食小鼠的小肠取下后去除掉
                  小肠上皮是机体营养感受与吸收的首要部位，                          粪便及肠道黏液，用 EDTA 将小肠的上皮层和黏膜
              在机体能量稳态调节中发挥着重要功能。HFD 可                           层分开，低速离心后去除沉淀和细胞碎片，再经过
              以改变小肠细胞微环境，导致肠道屏障功能下降，                            超速离心（100 000 g）后获得小肠上皮组织来源的
                                               ［4］
              炎症增加，引起吸收和分泌功能异常 。众所周知，                           外泌体。利用BCA法测定外泌体浓度。
              小肠是重要的内分泌器官，可以感受各种饮食成                             1.2.3 成年鼠原代心脏成纤维细胞培养
              分、微生物及代谢产物，在饮食对机体的调控中也                                 3 月龄 C57BL6J 小鼠（南京医科大学实验动物
              起着重要作用，例如肠道内分泌细胞产生的胰高血                            中心），颈椎脱臼处死后在 75%乙醇中消毒后剪开
              糖素样肽⁃1（glucagon⁃like peptide⁃1，GLP⁃1）受体激          胸腔，快速取出心脏，并去除大血管及心房，将心
              动剂可以逆转 HFD 和血管紧张素Ⅱ诱导的心肌重                          室组织剪碎后用Ⅱ型胶原酶（0.1%）消化（37 ℃，
                             ［5］
              构和心功能下降 ，说明小肠上皮直接参与 HFD 诱                         200 r/min 恒温摇床），反复多次消化干净后将上清
              导的心血管疾病的发生，对于维护机体代谢健康具                            通过 40 μm 筛网过滤，1 000 r/min 离心 10 min，弃上
              有重要意义。小肠上皮还可以通过分泌包含多种                             清液，用适量完全培养基重悬沉淀（心肌细胞及成
              mRNA、microRNA、功能性蛋白质的外泌体 激活或                      纤维细胞）并铺板，90 min 后，通过差速贴壁法留取
                                                    ［6］
              进入受体细胞，发挥通讯及调控作用。然而，目前                            心脏成纤维细胞。
              还未有小肠上皮组织外泌体对心脏纤维化影响的                             1.2.4 细胞处理及外泌体示踪
              研究报道。                                                  将提取的外泌体进行亲脂性染料 PKH26 荧光
                  本研究通过对小肠上皮组织外泌体与心脏成                           染色，将 PKH26 荧光染色的外泌体加入用无外泌体
              纤维细胞共培养，观察心脏成纤维细胞增殖分化、                            血清培养 3 d 的小鼠原代心脏成纤维细胞中，共培
              胶原合成能力的变化，初步探讨HFD通过小肠上皮                           养 48 h。采用 DAPI 进行细胞核染色。荧光显微镜
              组织外泌体对心脏纤维化的影响，为进一步研究                             下相同曝光时间拍照，采用Image J软件计算两组相
              HFD引起心脏纤维化的机制提供基础。                                对荧光强度，对结果进行定量分析，评估两组外泌
                                                                体的心脏成纤维细胞摄取效率。
              1  材料和方法
                                                                1.2.5 实时荧光定量PCR
              1.1  材料                                                TRIzol 法裂解提取心脏成纤维细胞 RNA，测定
                  雄性 C57BL/6J小鼠，（南京大学动物模式中心、                    RNA 的含量和纯度。将 RNA 逆转成 cDNA，用相关
              南京医科大学实验动物中心），SPF 级环境，温度                          引物进行 RT⁃PCR 扩增。实时定量 PCR（ABI7000，
             （23 ± 1）℃。荧光定量 PCR 仪 ABI7000 StepOne⁃              StepOne⁃Plus，美国）的总反应体系为 10 μL，反应条
              Plus（ABI 公司，美国），荧光显微镜（IX⁃73，Olympus               件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸
              公司，日本）；胎牛血清（Gbico公司，美国），DMEM培                     15 s，40 个循环；72~94 ℃，每升高 0.5 ℃读 1 次制备
              养基（Thermo Fisher 公司，美国）；Ⅱ型胶原酶（SIG⁃                熔解曲线。以β⁃actin 基因作为内参，引物序列详见
              MA公司，美国）；α⁃SMA、Col1a1、Col3a1一抗及二抗                 表1。采用2     -ΔΔCT  法计算相对内参基因的扩增倍数。
             （Proteinech公司，美国）。                                 1.2.6 免疫荧光染色

              1.2  方法                                                细胞用4%多聚甲醛固定15 min后，0.1% Triton
              1.2.1 HFD动物模型制备                                   X⁃100 室温通透10 min，PBS洗涤后用山羊血清封闭
                  SPF 级雄性 3 周龄 C57BL/6J 小鼠（南京大学动                30 min，采用抗α平滑肌肌动蛋白（α⁃SMA）（1∶400）、
              物模式中心）在南京大学动物模式中心饲养，SPF级                          抗Ⅰ型胶原（1∶500）、抗Ⅲ型胶原（1∶200）一抗孵
              环境，分别设为正常饮食组（NCD 组）、高脂饮食组                         育过夜，用相对应的二抗孵育细胞。采用 DAPI 进
             （HFD 组）。正常饲料 3.8 kcal/g，营养成分配比：碳                   行核染色。荧光显微镜下观察并拍照。每组选
              水化合物 70%，脂肪 10%，蛋白质 20%。高脂饲料                      择 5 个视野，采用 Image J 软件计算荧光强度，对
              5.2 kcal/g，营养配比：碳水化合物20%，脂肪60%，蛋                  结果进行定量分析。
              白质 20%。HFD 共 12 周。HFD 处理结束后颈椎脱                    1.3 统计学方法
              臼法处死小鼠。                                                用 GraphPad Prism 8 统计软件进行分析，数据
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