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第43卷第6期            史薪炜，钱 骏，袁 超，等. 缺氧下调FTO并促进小鼠肺动脉平滑肌细胞迁移［J］.
                  2023年6月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（6）：802-806                        ·803 ·


                          ［5］
                基化修饰酶 。FTO能够通过氧化作用移除m6A修                          组取 10 μg 总蛋白进行 SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳、
                饰，广泛参与mRNA 的翻译、剪切、核输出及降解等                         转膜、5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，根据蛋白分子量剪
                影响mRNA命运的过程          ［6-7］ 。研究表明，FTO参与了           出合适的膜条带，分别与相应的一抗在 4 ℃孵育过
                PH 的发生   ［8-9］ ，FTO 在 PH 中的具体作用目前仍未               夜。TBST洗膜10 min×2次后加入HRP 标记的兔二
                知。本研究拟在缺氧环境下培养小鼠肺动脉平滑                             抗（1∶1 000）室温孵育 1 h，再次洗膜后加入 ECL 发
                肌细胞（mouse pulmonary artery smooth muscle cell，    光剂于暗室中显影、曝光，采用 Gel⁃Pro 软件对蛋白
                MPASMC），构建体外模型以探究 FTO 是否对缺氧                       灰度值进行定量分析。
                MPASMC的迁移发挥作用。                                    1.2.4 划痕实验检测细胞迁移
                                                                      用含 2%胎牛血清的培养基替换原培养基以排
                1  材料和方法
                                                                  除细胞本身增殖对实验结果的影响，使用200 μL移
                1.1  材料                                           液管的尖端在单层融合的 MPASMC 上划出数条划
                    MPASMC 购自中国科学院上海细胞库；DMEM                      痕。在划痕后0、12 h用荧光显微镜拍摄图像，观察
                培养基、胎牛血清（Gibco 公司，美国）；RIPA 裂解液                    划痕宽度的变化情况。在每条边上共选取 3 个点，

               （北京 Solarbio 公司）；抗β⁃actin、抗 FTO 抗体、HRP             间隔均匀，并测量划痕两边的距离。细胞迁移率的
                标记山羊抗兔二抗（Abcam 公司，美国）；脂质体 Li⁃                     计算公式如下：［划痕宽度（0 h）-划痕宽度（12 h）］/划
                pofectamine 3000、增强型ECL试剂盒（Invitrogen公            痕宽度（0 h）×100%。实验重复3次，并计算平均值。
                          TM
                司，美国）；FTO 过表达质粒（上海吉玛公司）；小鼠                        1.3 统计学方法
                FTO siRNA（siFTO，sc⁃75003）及阴性对照 siNC（sc⁃               所有数据均采用 GraphPad Prism 8 软件进行分
                36869）（Santa公司，美国）。                               析，正态分布的数据采用均数±标准差（x ± s）表示，两
                1.2  方法                                           组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计
                1.2.1 MPASMC缺氧培养                                  学意义。
                    MPASMC 在 含 有 10% 胎 牛 血 清 、1% 双 抗 的
                                                                  2  结 果
                DMEM培养基中培养，培养条件为37 ℃、5%CO2，达
                到70%~80%融合后转入三气培养箱进行缺氧培养，                         2.1  缺氧处理后FTO表达变化
                调整培养条件为37 ℃、1%O2、5%CO2，在缺氧培养后                         Western blot 检测常氧和缺氧处理的 MPASMC
                12 h取出细胞备用。                                       中的FTO蛋白表达水平，结果显示，与常氧组相比，
                1.2.2 细胞转染                                        缺氧组中 FTO 蛋白相对表达水平明显下降（1.01±
                    过表达转染实验：FTO 过表达质粒由吉玛公司                        0.06 vs. 0.54±0.04，P＜0.05，图1）。
                构建，用 PCR 得到目的基因 FTO 序列片段，然后将                      2.2  缺氧引起MPASMC迁移能力上调，过表达FTO
                其克隆到载体 pcDNA3.1（+）中，再进行重组质粒测                      预处理能显著减缓该过程
                                                        TM
                序，验证成功后抽提。转染按 Lipofectamine 3000                      划痕实验显示，缺氧处理后MPASMC迁移速度
                试剂说明书进行操作，在室温下转染5 μg质粒DNA                         显著加快［（74.63±2.70）% vs.（54.17±3.92）%，P＜
                到 MPASMC 中。以空载体 pcDNA3.1（+）作为对照。                  0.05，图 2］，用 FTO 过表达质粒转染细胞，Western
                转染48 h后收集细胞，Western blot验证转染效率。                   blot检测转染后FTO蛋白表达较转染空载体组明显
                    敲低转染实验：将冻干的 siRNA 在 330 μL 无                  上调（1.60±0.03 vs. 0.99±0.01，P＜0.05，图3A），提示

                RNA酶的水中重悬备用，待6孔板中细胞长到70%~                         转染成功。而在过表达FTO后再进行缺氧培养，相比
                80%密度时，按Lipofectamine 3000试剂说明书，在                 转染空载体组，MPASMC迁移速率显著减慢［（75.10±
                                         TM
                室温下分别将 5 μg 的 siFTO 及其阴性对照 siNC 转                 1.19）% vs.（51.87±2.57）%，P＜0.05，图4］。

                染至 MPASMC 细胞，转染 48 h 后收集细胞，Western                2.3  常氧状态下敲低FTO促进MPASMC迁移
                blot验证转染效率。                                           为进一步证明 FTO 对于 MPASMC 迁移能力的
                1.2.3 Western blot检测β⁃actin、FTO蛋白表达               影响，在常氧培养条件下敲低 FTO 表达，再次检测
                    用细胞刮刀刮下细胞，低温离心机以 4 ℃、                         MPASMC迁移能力。Western blot 结果显示，敲低组
                1 000 r/min 条件离心 5 min 收集细胞；用 RIPA 裂解            （siFTO 组）FTO 蛋白表达较阴性对照组（siNC 组）显
                液提取细胞总蛋白，BCA 法进行蛋白浓度定量；各                          著下调，提示敲低成功（0.29±0.04 vs. 1.10±0.02，P＜
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