Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第6期
·750 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年6月

RISC） ［6- 7］ ，再释放 siRNA 的随从链从而激活 RISC。 级）雄性小鼠（南京医科大学实验动物中心），本研
激活后的RISC在siRNA的引导链的指导下降解其同 究经南京医科大学实验动物福利伦理委员会批
［8］
源互补的mRNA，从而沉默特定基因的表达 。shRNA 准。Oligo（上海生工公司）；限制性内切酶 BglⅡ、
（short hairpin RNA）载体在细胞核内转录为pri⁃shRNA HindⅢ、XbaⅠ、XhoⅠ、CutSmart Buffer、10×NEB Buf⁃
（primary shRNA），然后在双链RNA结合蛋白DGCR8 fer3.1（NEB 公司，美国）；FastPure Gel DNA Extrac⁃
和 Drosha 蛋白的加工下形成 pre⁃shRNA（precursor tion Mini Kit（南 京 Vazyme 公 司）；EndoFree Mini
shRNA） 。pre⁃shRNA 在 Exportin⁃5 等蛋白因子的 Plasmid Kit Ⅱ（TIANGEN公司，美国）；胰酶、胎牛血
［9］
协助下从细胞核转运至细胞质 ［10］ 。细胞质中的 清、DMEM（Gibco 公司，美国）；琼脂糖（上海生工公
pre⁃shRNA在Dicer酶等蛋白因子加工下去除其茎环 司），TRIzol（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；
结构成为siRNA，从而启动RNAi过程来沉默目的基 RT reagent Kit（TaKaRa 公司，日本）；DAPI（Sigma 公
［11］
因表达 。基于这一原理，有研究者设计靶向特定序 司 ，美 国）；花 生 凝 集 素（peanut agglutinin，PNA）
［12］
列的shRNA敲降载体，从而诱导RNA特异性降解 。 （Vector Labs公司，美国），EGFP抗体、Sox30抗体、二
传统的基因敲除动物模型一般使用 CRISPR/ 抗（Abclonal公司，美国）。
Cas9 等基因编辑技术进行遗传学模型的构建 ［13］ 。 1.2 方法
即使 CRISPR/Cas9 技术经过多年发展已经趋于成 1.2.1 Oligos退火形成双链
熟，但仍存在耗时较长、费用较高、不能在特定时间 将公司合成的 shSox30⁃oligo1 和 shSox30⁃oligo2
点敲除目的基因，以及脱靶效应等诸多问题 ［14］ 。同 用高压灭菌后的ddH2O溶解。按照4 μL oligo1、4 μL
时，某些基因的敲除小鼠模型存在胚胎死亡现象， oligo2、2 μL 10×NEB buffer2、10 μL ddH2O配置退火体
常导致实验人员无法得到敲除小鼠。为了规避这 系。95 ℃水浴退火5 min，自然冷却至室温，4 ℃保存。
些问题，需要研究者开发一个快速、特异、安全的睾 1.2.2 载体线性化
丸原位基因敲减平台。近些年来，很多研究通过向 空载环状的 pSilencer 载体按照 2 μg pSilencer
睾丸递送 siRNA ［15］ 或反义寡核苷酸（antisense oli⁃ 载体、1 μL XbaⅠ内切酶、1 μL XhoⅠ内切酶、5 μL
［16］
gonucleotides，ASO） 来完成睾丸特定基因的敲 CutSmart Buffer，再 加 ddH2O 补 齐 至 50 μL 体 系 ，
减。虽然向小鼠睾丸递送 siRNA 和 ASO 可以规避 37 ℃水浴 3 h。将酶切后的产物在 1%琼脂糖凝胶
CRISPR/Cas9等基因技术存在的问题，但也存在着作 中电泳30 min，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的
用时间维持较短的问题 。shRNA敲降载体具有表 产物。空载的pSuper载体分两步进行酶切，先按照
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达shRNA的元件，可以通过慢病毒整合到基因组上 2 μg pSuper 载体、1 μL BglⅡ内切酶、5 μL 10×NEB
稳定表达。研究者可以向小鼠睾丸递送shRNA慢病 Buffer 3.1，加 ddH2O 补齐至 50 μL 体系，37 ℃水浴
毒敲降载体基因来维持稳定、长效的基因表达沉默。 3 h。线性产物使用试剂盒纯化后，再按照 2 μg
本研究通过构建靶向Sox30基因的shRNA慢病毒敲 pSuper线性载体、1 μL HindⅢ内切酶、5 μL 10×NEB
降载体，通过网微注射进入出生24 d小鼠睾丸来敲降 Buffer2.1，加 ddH2O 补齐至 50 μL 体系，37 ℃水浴
Sox30基因转录本，观察Sox30蛋白是否可被持续敲 3 h。1%琼脂糖凝胶中电泳30 min，使用DNA凝胶回
降，及生精管腔中生殖细胞是否有发育异常现象。 收试剂盒纯化产物得到双酶切的线性pSuper产物。
同样地，pSuper⁃shSox30按照pSuper酶切体系酶切。
1 材料和方法
1.2.3 pSuper⁃shSox30 与 pSliencer⁃GFP⁃shSox30 的
1.1 材料 连接与鉴定
实验所使用的小鼠均为 24 日龄 C57BL/6J（SPF 20 ng线性pSuper载体、1 μL 10×T4 Buffer、1 μL
表1 shSox30核苷酸序列
Table 1 The oligonucleotide sequences of shSox30

基因 序列（5′→3′）
shSox30⁃1⁃Oligo1 GATCCCCGCCTTCTGAGTTGATACGGTTTTCAAGAGAAACCGTATCAACTCAGAAGGCTTTTTGGAAA
shSox30⁃1⁃Oligo2 AGCTTTTCCAAAAAGCCTTCTGAGTTGATACGGTTTCTCTTGAAAACCGTATCAACTCAGAAGGCGGG
shSox30⁃2⁃Oligo1 GATCCCCCCTTTCAGAGACTATCCAGATTTCAAGAGAATCTGGATAGTCTCTGAAAGGTTTTTGGAAA
shSox30⁃2⁃Oligo2 AGCTTTTCCAAAAACCTTTCAGAGACTATCCAGATTCTCTTGAAATCTGGATAGTCTCTGAAAGGGGG