Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第6期
               ·752 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年6月


                             A
                                               E1⁃3   E4               E5
                                      Sox30
                               shSox30⁃1：5′⁃GCCTTCTGAGTTGATACGGTT⁃3′ shSox30⁃2：5′⁃CCTTTCAGAGACTATCCAGAT⁃3′
                B                                    C
                        H1  shSox30 CMV  GFP               pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃1     pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃2
                   LTR                       LTR       1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415    1 2 3 4 5 6 7 8
                        pSliencer⁃GFP⁃shSox30                                 ← 426 bp                ← 426 bp
                                Amp
                          D
                              pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃1
                                               Sense          Loop         Antisense
                               GATCCCCGCCTTCTGAGTTGATACGGTTTTCAAGAGAAACCGTATCAACTCAGAAGGCTTTTTGGAA
                            2号  GATCCCC∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶ TTTTTGGAA







                              pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃2
                                               Sense          Loop         Antisense
                               GATCCCCCCTTTCAGAGACTATCCAGATTTCAAGAGAATCTGGATAGTCTCTGAAAGGTTTTTGGAA
                            1号  GATCCCC∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶ TTTTTGGAA







                 A：shRNA设计模式图及序列；B：pSilencer⁃GFP⁃shSox30慢病毒表达载体构建策略，GFP表达由CMV（cytomegalovirus）启动子驱动，shSox30
              表达由H1启动子驱动，LTR（long terminal repeats，长末端重复序列）；C：左图为pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃1连接产物菌落PCR结果，其中：2、3、4、
              6、7、9、12、14 成功连接；右图为 pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃2 连接产物菌落 PCR 结果，其中：1、5、6、7 成功连接；箭头所指为成功连接后的目的片
              段；D：pSliencer⁃GFP⁃shSox30测序结果；Sense序列为识别靶标mRNA的部分，Loop序列可以形成shRNA的茎环结构，Antisense序列为Sense序
              列的互补序列。
                                                图1 shRNA设计模式图及载体构建
                     Figure 1 Schematic illustration of shRNA and the result of pSliencer⁃GFP⁃shSox30 expression constructed

              生精管腔发育至圆形精子阶段，在第24天完成发育                           Sox D 亚家族成员 Sox5、Sox6，分别进行 RT⁃qPCR 和
              并逐步过渡至长型精子阶段。为了探究Sox30敲降                          Western blot 实验。同对照组相比，注射 48 h 后，实
              对精子变形过程的影响，选取出生后24 d的野生型                          验组中 Sox5 和 Sox6 的 mRNA 水平无显著性差异，
              雄鼠，通过网微注射将 pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃2 重              Sox5和SOX6的蛋白水平在两组中差异无统计学意
              组质粒注射至小鼠生精小管中，在重组质粒持续表                            义（图3C~E）。以上结果提示，本研究中的敲减体系
              达并敲降 Sox30 转录本 48 h 及 7 d 后，收集小鼠睾                 不存在脱靶效应。
              丸样品。本研究中提取小鼠睾丸总蛋白和 RNA，                           2.4  Sox30敲降小鼠生殖表型观察
              分别进行 RT⁃qPCR 和 Western blot 实验，系统验证                    选取注射后 48 h 的对照组和实验组睾丸制备
              睾丸组织中 Sox30 在 mRNA 水平和蛋白水平的敲                      组织切片，根据 EGFP 在生殖细胞中的荧光信号明
              降效率。发现注射 48 h 后，实验组中 Sox30 基因                     确 shRNA 感染的细胞类型。结果显示，注射 48 h
              mRNA 水平下降，仅为对照组的 20%，蛋白表达量                        后，在前细线期精母细胞（preleptotene，PL）、偶线期
              约为对照组的一半，注射 7 d 后，实验组中 Sox30 基                    精母细胞（zygotene，Zyg）、粗线期精母细胞（pachy⁃
              因 mRNA 水平为对照组的 60%~70%，蛋白表达水                      tene，Pac）、圆形精子细胞（round spermatid，RS）、减
              平降低（图 3A、B）。                                      数第一次分裂中期细胞（metaphase I，MI）以及睾丸

                  Sox蛋白家族分为A~H亚型。Sox30属于Sox H                   体细胞支持细胞（sertoli，Ser）中观察到绿色荧光信
              亚家族，且为唯一成员。为了明确 shSox30 敲减系                       号（图 4A）。以上提示本研究中的shRNA敲降系统
              统是否存在脱靶效应，选取与 Sox30 同源性最近的                        成功感染多类型生殖细胞。进一步选取注射后7 d的
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