Page 11 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第6期 龚 洁，卜治文，徐 晨，等. 利用shRNA慢病毒高效敲降雄性小鼠睾丸基因［J］.
2023年6月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（6）：749-755 ·753 ·

A 对照组 实验组1 实验组2

明场

荧光

Merge

B C D
（ % ） 150 1.5 *** *** 空白对照组 对照组 实验组1 实验组2 M
过表达组
阳性细胞相对比例 100 mRNA相对表达量 1.0 （100 kDa） 150 kDa
Sox30
100 kDa
0.5
50
75 kDa
50 kDa
β⁃Actin
0
对照组 实验组1 实验组2 Sox30 0 对照组 （42 kDa） 37 kDa
空白对照组 过表达组 实验组1 实验组2
A：293T细胞转染后绿色荧光蛋白表达情况，标尺为100 μm（×100）；B：对照组和实验组中荧光信号阳性细胞统计（n=3）；C：shSox30干扰
效率的RT⁃qPCR鉴定（两组比较， P < 0.001，n=3）；D：shSox30干扰效率的Western blot鉴定。
***
图2 评估shRNA介导的基因敲降效率
Figure 2 Evaluation of shRNA mediated knock⁃down efficiency

对照组和实验组睾丸制备成组织切片，观察圆形精子 过网微注射将慢病毒敲降载体注射进出生 24 d 雄
发育进程。PNA可特异性识别圆形精子顶体蛋白，根 鼠睾丸的输出小管，使其进入生精小管管腔。处理
据顶体蛋白覆盖面角度可区分圆形精子的发育时 48 h和7 d后，分别收集小鼠睾丸进行实验验证。本
期。圆形精子发育至 2~3 步时顶体蛋白染色呈 1~ 研究利用 RT⁃qPCR、Western blot 实验，从体外和体
2 个小点，发育至4~6步时顶体蛋白覆盖面角度逐渐 内水平验证shRNA体系具备高效敲减效率，且敲减
延展至120°。免疫荧光结果显示，实验组中生精管 效率至少可持续 1 周。采用 PNA 进行免疫荧光，结
腔内圆形精子发育阻滞在 2~3 步，无法正常发育至 合睾丸组织免疫组化实验，证实了该体系成功敲降
长型精子阶段（图 4B）。苏木素⁃伊红染色结果显 生殖细胞重要转录因子 Sox30 的表达，观察到圆形
示，实验组睾丸生精小管Ⅶ~Ⅷ管腔中明显缺少长 精子发育阻滞在第2~3步，Ⅶ~Ⅷ期生精管腔中无长
型精子（图4C）。 型精子，实验组中产生了与 Sox30 全敲雄性小鼠类
似的生殖表型。
3 讨 论
精子发生是一个连续且有序的生理过程，涉及
本研究特异性设计靶向 Sox30 基因转录本的 精原干细胞的自我更新、精母细胞的减数分裂，以
shRNA 序列，将shRNA 构建进入pSilencer 载体中形 及单倍体精子的变形过程 ［18-19］ 。某一精子发生相关
成pSliencer⁃GFP⁃shSox30敲降载体。利用慢病毒包 基因可能在精子发生的多个阶段都发挥功能。传
装系统形成侵染能力较强的慢病毒敲降载体，并通 统的基因敲除模型可能在生精细胞发育分化的较