Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第6期
               ·758 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年6月


                               表1 DAI评分                         组、LPS+HCQ处理组；LPS刺激前，加入HCQ预处理
                            Table 1 Score of DAI                1 h；每孔加入1 μL浓度为20 μmol/L的Sytox Green以
               得分     体重下降       粪便性状       大便隐血/肉眼血便           及1 μL浓度为1 mg/mL的Hoechst 33342，充分混匀、
               0        ≤1%        正常             正常
                                                                培养箱中培养 3 h、每孔加入 33.3 μL 4%多聚甲醛、
               1      ＞1%~5%    松散/半成形          隐血阳性
                                                                4 ℃过夜，使用细胞成像仪检测。
               2     ＞5%~10%    松散/半成形          隐血阳性
                                                                1.2.7 活性氧检测
               3     ＞10%~20%   稀便/不成形          肉眼血便
                                                                                                 6
               4       >20%     稀便/不成形          肉眼血便                 将中性粒细胞浓度调整至1×10 个/mL，每1 mL
                                                                溶液加入 0.5 μL 2，7⁃二氯荧光素二乙酸酯（2，7⁃di⁃
                             表2 组织病理评分                          chlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH⁃DA），37 ℃
                         Table 2 Score of histopatology         孵育15 min；孵育结束后使用PBS清洗2次，调整细
               分值                     描述                        胞浓度为2×10 个/mL，铺至96孔板，每孔100 μL，分
                                                                             5
               0    正常组织                                        别加入药物处理；使用荧光酶标仪测定荧光强度
               1    轻度炎症伴少量炎症细胞浸润                               （通道为488 nm/525 nm），每隔10 min测量1次。
               2    较多炎症细胞浸润，隐窝及上皮破坏，杯状细胞黏
                                                                1.2.8 Western blot实验
                    液分泌减少
                                                                     配置10% SDS⁃PAGE凝胶，100 V恒压电泳。裁
               3    黏膜和黏膜下层较多炎症细胞浸润，伴隐窝脓肿，
                                                                剪PVDF膜，在甲醇溶液中浸泡30 s激活，倒入预冷
                    上皮严重破坏
                                                                的转膜液，冰上 250 mA 恒流转膜 1 h；将膜置于
               4    炎症细胞浸润黏膜全层，隐窝完全消失
                                                                TBST 溶液中漂洗5 min、转移至5%脱脂牛奶封闭液
              次 5 min；滴加免疫荧光二抗（Anti⁃Rabbit lgG⁃Alexa            中、室温下摇床孵育1 h；加入一抗（浓度1∶1 000）4 ℃
              Fluor488、Anti⁃Mouse lgG⁃Alexa Fluor594，1∶200）工    过夜孵育；TBST 中漂洗 3 次，每次 10 min；将条带
              作液；37 ℃孵育1 h；滴加DAPI，室温下孵育15 min；                  置于二抗中（浓度 1∶10 000），室温下缓慢摇动孵育
              滤纸吸去切片表面液体，滴加荧光抗淬灭剂，荧光                            2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；将显影液均匀淋于
              显微镜下观察。                                           条带上，使用天能凝胶成像系统进行显影。
              1.2.4 外周血中性粒细胞提取                                  1.3  统计学方法
                  EDTA 抗凝管收集健康志愿者外周血 3 mL，将                          本 研 究 数 据 采 用 SPSS 22.0 以 及 GraphPad
              外周血加入含5 mL中性粒细胞分离液的离心管后离                          Prism 9 进行分析。符合正态分布的数据资料以均
              心，吸取多核细胞以及分离液，转移至另一个15 mL                         数±标准差（x ± s）表示，两组连续性变量数据比较采
              离心管，加入 PBS，400 r/min 离心 10 min 收集细胞；              用独立样本t检验，3组及3组以上连续性变量的比较
              弃上清，加 2 mL 红细胞裂解液，3 min 后加 PBS，                   采用单因素方差分析（One⁃way ANOVA），其中两两
              340 r/min 离心 8 min；弃上清、用含有 10% FBS 的              比较采用LSD法。P < 0.05为差异有统计学意义。
              RPMI1640培养基重悬细胞。
                                                                2  结 果
              1.2.5 定量检测NET释放量
                  将中性粒细胞以 2×10 个/孔的密度铺至 96 孔                    2.1 HCQ减轻DSS结肠炎模型鼠的肠道炎症
                                       4
              板中，培养体积为 100 μL。将细胞分为 3 组：对照                           与DSS诱导的结肠炎模型鼠相比，给予HCQ灌
              组、LPS 组、LPS+HCQ 组。在 LPS 刺激前，先加入                   胃后结肠炎小鼠体重下降有减缓趋势（图 1A）。
              HCQ预处理1 h；每孔加入1 μL浓度为20 μmol/L的                   DAI 评分：与 DSS 组相比，予以 HCQ 后，结肠炎小鼠

              Sytox Green 以及 1 μL 浓度为 1 mg/mL 的 Hoechst         DAI评分明显降低（图1B）。小鼠结肠大体及长度：
              33342。培养箱中培养3 h、使用荧光酶标仪（通道为                       与 DSS 组相比，DSS+HCQ 组小鼠肠腔稀便、黏膜充
              350 nm/461 nm 以及 488 nm/525 nm）定量分析，以             血水肿较DSS组减轻，且结肠缩短程度减轻（图1C、
              Sytox Green 荧光强度/Hoechst 33342 荧光强度计算             D）。结肠组织 HE 染色病理评估：与 DSS 组相比，
              出的比值进行比较。                                         DSS+HCQ组小鼠结肠上皮及隐窝的破坏明显减轻，
              1.2.6 免疫荧光检测NET释放情况                               腺体结构部分恢复，且固有层及黏膜下层炎性细胞
                  96 孔板中每孔加入 50 μL 多聚赖氨酸溶液                      的浸润明显减少（图1E），组织病理学评分也明显降
             （0.1 mg/mL）包被。细胞分为3组：对照组、LPS刺激                     低（图1F）。
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