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第43卷第6期     江婧月，张红杰. 羟氯喹抑制MEK/ERK/ROS通路减少中性粒细胞胞外诱捕网形成改善葡聚糖硫酸钠
                  2023年6月             诱导的小鼠结肠炎［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（6）：756-763                   ·757 ·


                release of ROS by inhibiting the MEK/ERK signal pathway，thereby reducing the intestinal damage caused by NET.
               ［Key words］ ulcerative colitis；hydroxychloroquine；neutrophil extracellular traps；reactive oxygen species
                                                                              ［J Nanjing Med Univ，2023，43（06）：756⁃763］





                    溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是胃肠道             血压、冠心病、糖尿病及自身免疫性疾病等，健康志
                                       ［1］
                慢性非特异性炎症性疾病 。近年来，UC的发病率                           愿者10例，采集3 mL外周血，分离中性粒细胞。本
                               ［2］
                呈逐年上升趋势 。目前 UC 发病机制仍未完全明                          研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会审
                确，研究提示免疫失调、菌群紊乱、肠屏障破坏、遗                           批通过（伦理号 2021SR192），所有参与者已签署知
                传易感性等与UC发病相关            ［3-5］ ，肠道免疫失调在UC          情同意书。
                                 ［6］
                的发病中尤为重要 。在固有免疫细胞中，中性粒                            1.1.2 实验动物
                细胞是炎症反应的第一应答者，研究发现活动期UC                               本研究使用清洁级雄性 C57BL/6 鼠，购自北京
                                                       ［7］
                患者损伤的肠黏膜中有大量中性粒细胞浸润 。                             维通利华实验动物技术有限公司，在南京医科大学
                    中性粒细胞促进炎症形成的关键机制是中性粒                          实验动物基地饲养。研究经南京医科大学实验动
                细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap，NET）        物 福 利 伦 理 委 员 会 批 准（批 文 编 号 ：IACUC ⁃
                的释放   ［8-9］ 。NET是由解聚的染色质及髓过氧化物酶                   2106043）。MEK、p⁃MEK、ERK、p⁃ERK 抗体（Cell
               （myeloperoxidase，MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶                   Signaling Technology 公司，美国），ECL 显影液（Ther⁃
               （neutrophil elastase，NE）组成 ，其诱导多种促炎细               mo Fisher 公司，美国），ROS 检测试剂盒（上海碧云
                                         ［10］
                胞因子分泌，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，              天科技公司），Sytox Green 染色液、Hoechst33342 染
                TNF）⁃α、白介素（interleukin，IL）⁃1β等，参与自身免疫             色液（Thermo Fisher 公司，美国），4%多聚甲醛（武汉
                性疾病的发生。研究发现活动期UC患者肠道组织及                           赛维尔生物公司）。
                外周血中NET水平明显升高，提示NET参与UC炎症的                        1.2  方法
                   ［11］
                形成 ，但NET在肠道炎症形成中的机制仍未明确。                          1.2.1 DSS肠炎模型及动物分组
                    研究发现自噬及活性氧（reactive oxygen spe⁃                   雄性 C57BL/6 小鼠（6~8 周龄，体重 18~22 g），
                cies，ROS）参与 NET 形成    ［12］ ，ROS 生成是 NET 形成        SPF 环境中适应 1 周后随机分 3 组：对照组（n=6）、
                的必要条件     ［13］ ，而既往研究表明 MEK/ERK 信号通               DSS 组（n=6）、DSS+HCQ 组（n=6）。对照组：全程自
                路激活后可诱导 ROS 的释放           ［14］ 。羟氯喹（hydroxy⁃      由饮水，每天给予1次200 μL纯水灌胃；DSS模型组：
                chloroquine，HCQ）是4⁃氨基喹啉衍生物类药物，具有                  自由饮用3%DSS溶液，同时每天给予1次200 μL纯
                抗炎、免疫调节作用，其作为自噬抑制剂，可抑制ROS                         水灌胃；DSS+HCQ 处理组：自由饮用 3%DSS 溶液，
                释放，已被用于包括胰腺癌在内的肿瘤治疗                   ［15-16］ 。也  同时每天给予 1 次 200 μL HCQ（60 mg/kg）灌胃。
                用于自身免疫性疾病的治疗              ［17］ 。既往研究提示，           1.2.2  疾病活动指数（disease activity index，DAI）和
                HCQ通过Toll样受体9抑制肝缺血再灌注模型小鼠                         标本采集
                                  ［18］
                肝脏组织中NET形成 。                                          每日观察小鼠精神状态，记录各组小鼠体重，
                    前期研究发现 HCQ 可减低葡聚糖硫酸钠（dex⁃                     记录粪便性状并进行隐血试验，根据表 1 进行 DAI
                tran sulfate sodium salt，DSS）诱导的结肠炎，HCQ 能         评分  ［19］ 。造模结束后颈椎脱臼法处死小鼠，留取肠
                否抑制肠道组织中 NET 形成而减轻 UC 肠道炎症，                       组织标本，固定、包埋、切片、HE 染色、显微镜下观
                仍不清楚。本研究构建 UC 肠炎模型，通过动物和                          察结肠黏膜损伤结构及炎症细胞浸润，根据表 2 进
                细胞实验探讨 HCQ 是否可以通过抑制 NET 形成减                       行组织病理评分。
                轻结肠炎症及其机制。                                        1.2.3 免疫荧光

                                                                      石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复后，滴加 10%
                1  材料和方法
                                                                  山羊血清37 ℃下孵育1 h；滴加瓜氨酸化组蛋白H3
                1.1  材料                                          （citrullinated histone H3，citH3）和中性粒细胞弹性
                1.1.1 健康志愿者                                       蛋白酶（neutrophil elastase，NE）一抗工作液（1∶100）
                    本研究纳入健康体检者，排除胃肠道疾病，无高                         4 ℃过夜孵育；第 2 天使用 1×PBS 润洗切片 3 次，每
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