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第43卷第6期 龚 洁，卜治文，徐 晨，等. 利用shRNA慢病毒高效敲降雄性小鼠睾丸基因［J］.
2023年6月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（6）：749-755 ·751 ·
T4 DNALigase、再加双链 Oligos 补足至 10 μL 体系， 1.3 统计学方法
16 ℃过夜连接。连接产物转化，涂氨苄抗性平板， 实验数据结果采用GraphPad Prism7软件分析，
挑单克隆菌落，经菌落PCR后初步选取阳性菌落送 符合正态分布的定量数据结果以均数±标准差（x ±
测序验证。测序验证成功连接的pSuper⁃shSox30，酶 s）表示。两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用
切（同1.2.2）回收小片段，与线性pSilencer按照 20 ng 单因素方差分析，组间两两比较采用 Dunnett⁃t 检
pSilencer、20 ng pSupersh⁃shSox30 小片段、1 μL 10× 验，P < 0.05为差异有统计学意义。
T4 Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、ddH2O 补至 10 μL，
2 结 果
16 ℃过夜连接。连接产物转化，挑取单克隆菌落测
序验证。 2.1 shRNA载体的构建
1.2.4 293T细胞培养与转染 为了成功敲降小鼠睾丸内 Sox30 基因的表达，
293T 细胞用含 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉 将特异性shRNA靶标序列分别设计在Sox30基因的
素、100 U/mL 链霉素的 DMEM 培养基于 37 ℃、5% 1号外显子和5号外显子区域（图1A）。利用同源重
CO2的恒温培养箱常规培养，每1~2 d换液1次，当细 组方法构建pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃1，pSliencer⁃GFP
胞密度达 70%~80%时转染。按照 2.5 μg 质粒、 ⁃shSox30⁃2 敲减载体和 pSliencer⁃GFP⁃shScramble 对
50 μL 0.5 mmol/L CaCl2、100 μL 2×HBS，加水补齐至 照载体，转化进原核细胞 DH5α后 PCR 筛选 sense⁃
200 μL配置转染试剂。转染后36~48 h收样。空白 Loop⁃antisense片段插入成功的阳性单克隆菌落，通用
组为未转染质粒组，过表达组为单转 Sox30 过表达 引物H1和CMV⁃R进行PCR扩增，目的条带为426 bp
质粒 PRK5⁃HA⁃Sox30，对照组为 Sox30 过表达质粒 （图 1B、C）。阳性菌落提取质粒进行测序，Sense⁃
PRK5⁃HA⁃Sox30 与 shScramble 共转染，实验组为 Loop⁃Antisense 序列测序结果正确的pSliencer⁃GFP⁃
Sox30过表达质粒PRK5⁃HA⁃Sox30分别与shSox30⁃1、 shSox30⁃1和pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃2质粒用作后续
shSox30⁃2共转染。 敲降实验（图1D）。
1.2.5 RNA提取与RT⁃qPCR 2.2 shRNA敲降效率的验证
细胞加入TRIzol试剂，冰上研磨至组织充分裂解， Sox30 是生殖细胞特异表达的转录因子，为了
12 000 r/min 4 ℃离心 30 min，取上清并加入 200 μL 在体外验证两条 shRNA 的敲降效率，将构建好的
氯仿，剧烈摇晃后室温静置 3 min，12 000 r/min 4 ℃ pSliencer⁃GFP⁃shScramble、pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃1
离心 30 min，取上清并加入等体积的异丙醇，静置 或 pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃2 重组质粒分别与 Sox30
10 min 后 12 000 r/min 4 ℃离心 15 min，75%乙醇清 过表达PRK5⁃HA⁃Sox30质粒共转入293T细胞中，未
洗沉淀后加入适量 DEPC水溶解 RNA。通过紫外可 转染的细胞作为空白对照组。转染后继续培养36 h
见分光光度计检测 RNA浓度和纯度；采用TaKaRa的 后收取细胞样品进行 RT⁃qPCR 和 Western blot 实
PrimeScript RT reagent Kit逆转录试剂盒合成 cDNA， 验。重组质粒带有 EGFP 标签，荧光显微镜下发现
qPCR反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。 50%以上的293T细胞都是EGFP 阳性细胞（图2A），
1.2.6 慢病毒包装与网微注射 且实验组和对照组间的阳性细胞比例差异无统计
病毒上清溶液在4 ℃、50 000 g转速下离心90 min 学意义（图 2B）。RT⁃qPCR 实验分别检测空白对照
以获得高滴度的慢病毒。再使用高滴度的慢病毒 组、过表达组、对照组、实验组 1、实验组 2 中 Sox30
包装 pSilencer⁃GFP⁃shSox30 敲降载体形成慢病毒 基因的 mRNA 水平，结果显示两组实验组的 Sox30
敲降载体。慢病毒敲降载体与台盼蓝染液混合 转录本表达量显著下降，仅为过表达组的30%~40%
后使用毛细管注射进入出生 24 d 的小鼠睾丸生 （图2C）。Western blot结果显示两组实验组中Sox30
精小管。 蛋白表达量下降，约为过表达组的 40%~50%（图
1.2.7 免疫荧光检测 2D）。其中实验组2在Sox30 mRNA水平和蛋白水平
TBS清洗组织切片后用 1%TBST配制的含 10% 的敲降效率更高，用于后续睾丸组织病毒注射实验。
鸡血清的封闭液室温封闭 1 h，一抗稀释液（EGPF 2.3 Sox30敲降小鼠模型的构建及验证
抗体 1∶500）4 ℃过夜孵育，加入二抗稀释液（PNA+ 根据细胞实验中 shSox30 的敲减效率结果，选
绿色荧光二抗1∶100）37 ℃孵育 1 h，TBS清洗 3次后 取敲减效率较高的pSliencer⁃GFP⁃shSox30⁃2 重组质
滴加DAPI封片，荧光显微镜拍片保存。 粒用于构建小鼠敲降模型。小鼠出生后 18 d 睾丸
