Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第7期
               ·894 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年7月


              完成，在最初卵泡形成的时候，卵巢的整体组织结
                                                                1 材料和方法
              构发生了巨大的变化，细胞增殖分裂活动十分活
              跃 。卵泡组装的不同步决定了生殖细胞的异质                             1.1  材料
                ［4］
              性，3 种生殖细胞（包囊中的生殖细胞、经过包囊破                               成年 C57BL/6 雌性孕鼠来自北京 Vital River 实
              裂的生殖细胞和卵泡中的生殖细胞）在新生雌鼠                             验室，饲养于南京医科大学实验动物中心。所有
             （postnatal day 0.5，P0.5）卵巢中同时存在 。理论                动物实验方案均经南京医科大学动物实验伦理
                                                   ［5］
              上，这些生殖细胞中转录组的变化可以准确地代表                            委员会批准。小鼠在 22 ℃ 12 h/12 h 的明暗循环
              卵泡形成过程中的发育阶段转变。本实验前期通                             条 件下饲养，并提供充足的食物和水。微量总
              过对 P0.5 卵巢中收集的 146 个单个生殖细胞的转                      RNA 提取试剂盒（RNAprep Pure Micro Kit，DP420，
              录组进行测序，重建了卵泡组装过程中生殖细胞随                            北京天根生化科技有限公司），PCR 引物由南京擎
              时间的动态变化，构建了生殖细胞从包囊（E17.5）                         科生物技术有限公司合成，PCRmix（PN 176⁃5211，
              到包囊破裂（P0.5）再到卵泡形成（P2.5）的单向伪时                      Bio⁃Rad Laboratories，美国），逆转录酶（南京诺维赞
              间发育轨迹，并构建了细胞发育阶段相关的转录因                            公司），ABI StepOnePlus（赛默飞，美国），高通量荧光
                        ［6］
              子调控网络 。                                           定量 PCR 仪（Fluidigm，美国），显微镜（SMZ1000，尼
                  可变剪切，也叫选择性剪切，是指在 mRNA 前                       康）。
              体到成熟mRNA 的过程中，不同剪切方式使得同一                          1.2  方法
              个基因可以产生多个不同的成熟 mRNA，最终产生                          1.2.1  可变剪切与DAS事件的识别
              不同的蛋白质。可变剪切导致了转录本和蛋白质                                  数据来源于本实验室前期从初生小鼠卵巢中
              结构及功能的多态性，基因表达调控在适应性分化                            收集的 146 个单个生殖细胞转录组测序结果，NCBI
              和进化中起着核心作用，调控高度多样化的过程如                            GEO（Gene Expression Omnibus，https：//www.ncbi.
              细胞分化 ，但大多数研究只探索了转录本水平的                            nlm.nih.gov/geo/）数据库编号为GSE152407。
                      ［7］
              进化，而忽略了转录本结构的潜在重要作用 。作                                 7 种可变剪切事件包括跳跃外显子（skipping
                                                      ［8］
              为一种关键的基因表达调控机制 ，该过程在细胞                            exon ，SE）、可 变 的 5′ 和 3′ 剪 切 位 点（alternative
                                            ［9］
              分化和谱系确定、组织特性获取和维护以及器官发                            5′splice site，A5/alternative 3′splice site，A3）、保留
              育方面发挥作用，转录⁃剪切耦合调控已在雄性生                            内含子（retained intron，RI）、互斥外显子（mutually
              殖细胞发育中得到证明            ［10］ 。有丝分裂精原细胞向             exclusive exon，ME）以 及 可 变 的 第 一 个 外 显 子
              减数分裂精母细胞转变的过程中存在广泛的剪切                             （alternative first exon，AF）和可变的最后一个外显子
              转录本   ［11］ 。据报道，小鼠和人类 MⅡ期卵母细胞中                    （alternative last exon，AL），由 SUPPA2 （v2.2.1）识
                                                                                                  ［14］
              存在保守的阶段特异性转录变体                ［12］ 。成熟生发泡         别，并使用 GENCODE（vM20）注释作为参考。对
              卵母细胞中 Srsf3 的条件性缺失导致生发泡破裂                         于每个可变剪切事件，至少有一半的细胞有 PSI
             （germinal vesicle breakdown，GVBD）缺陷，其原因是可          （percentage or proportion spliced⁃in）值才认为可变剪
              变剪切异常和 B2 正弦转座因子受到抑制                 ［13］ 。这一     切事件存在于这个细胞簇中。然后，应用 SUPPA2
              结果显示了可变剪切调控母体转录组的建立。然                             来识别相邻细胞发育阶段中都存在且 P < 0.01 的
              而，迄今为止，关于卵母细胞发育过程中可变剪切                            DAS 事件。最后，使用 ggsashimi       ［15］ 绘制桑基图对多
              事件动态调控的研究还很少。                                     个样本的剪切事件进行可视化。
                  本研究通过对单个生殖细胞的转录组数据进                           1.2.2  实时定量PCR
              一步分析，揭示了卵泡组装过程中富集的可变剪                                  分别收集 E17.5、P0.5、P2.5 母鼠，在 Hanks 平

              切 事件以及差异可变剪切（differential alternative             衡盐溶液中小心地取出卵巢，按照说明书使用
              splicing，DAS）对卵母细胞命运的调控，卵泡形成时                     RNAprep Pure Micro Kit 试剂盒分离总 RNA。逆转
              可变剪切事件最为活跃，包囊破裂到卵泡形成转换                            录后，使用SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX
              时DAS事件最为富集，这为卵细胞转录本多样性或                           在 ABI StepOnePlus 平台上进行基于 Eva green 的
              蛋白质多样性提供了支持。这些 DAS 基因在卵母                          RT⁃PCR。以肌动蛋白扩增信号为内控，采用 2                   -ΔΔCT
              细胞发育各个阶段的动态差异表达也表明它们有                             方法量化各种mRNA。用熔解曲线分析评价PCR产
              着调节卵母细胞发育分化进程的作用。                                 物的特异性。引物序列见表1。
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