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第43卷第7期 孙文亚，何元林，陈秋臻，等. 小鼠原始卵泡形成过程中可变剪切的动态变化［J］.
2023年7月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（07）：893-899 ·895 ·

表1 实时定量PCR引物序列 表2 PCR引物序列
Table 1 Primer sequences of RT⁃PCR Table 2 Primer sequences of PCR
基因 序列（5′→3′） 基因 序列（5′→3′）

Alyref 上游CACTTTGAACGGAAAGCAGATG Sycp1 上游CATGCTCGAACAGGTTGCTA
下游CACGGTTTCTTGTCATGCCG 下游GCAGATCTAGCACAGGTTTCC
Ccdc12 上游CACCCCGGAAACCTGATTGG Hormad1 上游TGAAAGCAAAACAAGAAGCGG
下游CCTTTTAGCCGCTCACGGAT 下游AGATTCCAAGACGTGAAGGAC
Brdt 上游AGTGGGCGGTTGACGAATC Kdm1a 上游TGGATGAAAGCTTGGCCAAC
下游AGTCAGGCAGCTTTAGTTTCAC 下游TTTGAAAAGCTGCACCCTCC
Cdc5l 上游ATTCTGAAAGCAGCGGTAATGA Hnrnpa2b1 上游CGGAGGTCTTTCTCATCTCG
下游GATCCAGCCATTCGTACCATC 下游GCTTTCCCCATTGCTCATAG
Ddx1 上游CTCCGAAATGGGTGTTATGCC Mael 上游TTCCTCCCTTGTGAAATTGG
下游GCCATGAGTACATCCCCTCCT 下游GTTCCCTGGGTTTGGATGTA
Fmr1 上游CAATGGCGCTTTCTACAAGGC Gtsf1 上游GGGAGAGCTTCTGGACTGAG
下游TCTGGTTGCCAGTTGTTTTCA 下游TTTTCAGGGTCCAGGGAGTC
Hspa2 上游GCGTGGGGGTATTCCAACAT Eif4a2 上游GTGTCATCGAGAGCAACTGG
下游TGAGACGCTCGGTGTCAGT 下游ACTCAATCTCCAACTGTTGCA
Hspa8 上游TCTCGGCACCACCTACTCC Ncl⁃AF1 上游GAAAGTGGGAAGCAGTTGGG
下游CTACGCCCGATCAGACGTTT 下游CCTCTTCTCCACTGCTGTCA
Zranb2 上游GAATTTCCGAGTCAGTGACGG Ncl⁃AF2 上游GTTGTACGTGCTCCAGAGTC
下游CCCCAGCTTTCATCATCTTGG 下游CCTCTTCTCCACTGCTGTCA
Pabpc1 上游CAAGCCAGTACGCATCATGTG Ncl⁃AF1，Ncl⁃AF2 为 Ncl 的两种可变第一个外显子类型的同源
下游TGCTTCCTGTGTTTCAAAGTGT 异构体。
Rbm38 上游TGCTCCCCGAGTGTGTTTC
下游GTACTTTCTGAGCGATGCGTC
均被识别，其中 SE 类型可变剪切事件最为富集，
Strap 上游GTGGTGGATTTGGCCTTCAG
AF 其次（图1B），3个发育阶段细胞的可变剪切事件
下游GGCATCCTTATTCAATGTTGCAC
有较多重合，但仍存在差异（图1C）。每个发育阶段
1.2.3 聚合酶链式反应（PCR） 各类型可变剪切事件数目呈动态变化，卵泡形成时
为了测定同源异构体的分子量和相对表达量， 期各类型可变剪切事件最多，包囊时期其次，包囊
我们收集了 E17.5、P0.5、P2.5 母鼠卵巢，提取总 破裂时期最少，这表明在卵泡组装的进程中，卵泡
RNA，逆转录后，使用 Green Taq mix（Vazyme）进行 形成时期可变剪切的调控最为活跃。即通过可变
Touchdown PCR扩增，严格按照说明书操作，使用引 剪切产生的mRNA 和蛋白质亚型最多，从而调控功
物详见表2。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中以120 V 能性卵细胞的形成。
电泳30 min，使用Tanon 1600曝光检测DNA的表达， 2.2 卵泡组装过程中剪切因子变化
使用Image J对荧光强度进行分析，实验重复3次。 使用 SUPPA2研究单细胞水平不同阶段之间转
1.3 统计学方法 换时可变剪切的具体变化。小提琴图展示了剪切

所有测量均独立进行，至少重复3次。实时RT⁃PCR 因子在3个发育阶段表达的动态变化（图2A），其中
数据用均数±标准差（x ± s）表示，单因素方差分析评 Alyref、Ccdc12 的表达随着细胞发育呈上升趋势，
价组间差异。P < 0.05为差异有统计学意义。 在卵泡形成时表达最高，表明这两个剪切因子在
功能性卵泡形成时可能发挥重要作用，接下来用
2 结 果
RT⁃PCR 验证这几个剪切因子在 E17.5、P0.5 和 P2.5
2.1 卵泡组装过程中可变剪切事件 小鼠卵巢中表达量的变化（图2B）。
为了探究卵泡组装过程中可变剪切事件随着 2.3 卵泡组装过程中DAS事件
细胞发育的变化，分析了卵泡组装过程生殖细胞从 在从包囊到包囊破裂和从包囊破裂到卵泡形
包囊、包囊破裂到卵泡形成3个阶段（图1A）的可变 成的阶段转换中分别识别出 893 和 2 529 个 DAS 事
剪切事件。7 种可变剪切事件类型在 3 个发育阶段 件（P < 0.01），包囊破裂到卵泡形成中的 DAS 事件