Page 22 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 22

第43卷第8期
               ·1056 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年8月


                  Pumilio 家族蛋白是一类高度保守的 RNA 结合                   敲除小鼠是在第10和第11外显子之间插入β⁃geo基
              蛋白，在哺乳动物中存在 Pumilio1（Pum1）和 Pum⁃                  因造成基因缺陷。小鼠饲养于南京医科大学医药
              ilio2（Pum2）两种 Pumilio 蛋白，它们在结构上高度相                动物实验中心生殖医学国家重点实验室模式动物
                                           ［1］
              似，并且在靶标及功能上存在冗余 。Pum1、Pum2蛋                       研究基地SPF级动物房，室温控制在20~22 ℃，湿度
                                           ［3］
                            ［2］
                                                         ［4］
              白参与胚胎发育 、生殖细胞发育 、细胞周期进展 、                         50％~70％，光照周期 12 h/12 h。饲养过程中保持
              神经反应 和记忆形成 等生理过程，尤其与神经退                           充足食物和水，垫料每周更换 1 次。繁殖采用 1 只
                                  ［6］
                      ［5］
              行性疾病、癌症等人类疾病的发生发展有着重要的联                           雄鼠和2只雌鼠同笼的方式进行。实验动物使用获
              系。目前研究报道，Pumlilio通过不同途径调控多种                       得南京医科大学实验动物福利伦理审查委员会同
              肿瘤的发生发展 ，Pum1 在卵巢癌、前列腺癌、胰                         意（IACUC⁃1903052⁃1）。
                             ［7］
              腺癌和结肠癌中高表达，通过多种调控轴来影响肿                            1.2  方法
              瘤的增殖、转移和侵袭等          ［8-12］ ；Pum2 在子宫颈癌、乳腺        1.2.1 基因型鉴定
              癌和膀胱癌中的高表达预示着更短的生存期                      ［13-15］ ，     收取各组织后，剪下少量器官组织溶于50 mmol/L
              Pum1和/或Pum2在肿瘤细胞中的降低，可影响相应                        NaOH 溶液，沸水浴 30 min。冷却后加入 20 μL
              的肿瘤抑制因子，进而影响肿瘤的生长                  ［16-17］ 。因此，   1 mol/L的Tris⁃HCl（pH8.0）于涡旋仪混匀，12 000 r/min
              Pumilio是否可以作为肿瘤治疗靶标蛋白的关键，是其                       离心 5 min，取上清液进行 PCR 扩增。目的片段的
              缺失对生命机体的影响大小。由于Pumilio 对于细胞                       扩增序列和凝胶成像的产物大小见表1。

              的早期分化以及原肠胚形成过程至关重要，Pumilio                        1.2.2 BrdU实验
              双敲小鼠在胚胎期8.5 d死亡 ，出生后Pumilio 对个体                        将切片按以下顺序和时间处理：①切片脱蜡
                                      ［3］
              影响及功能研究显得尤为重要。                                    和水化；②去除内源性过氧化氢酶，3% H2O2 浸泡
                                          T2
                  本 研 究 利 用 R26 ⁃ CreER 小 鼠 与 Pum1       flox/flox  10 min。ddH2O洗3次，每次5 min；③胰蛋白酶消化
                   -/-                                T2        液37 ℃ 8 min，ddH2O 2 min×3次，37 ℃ ddH2O 5 min；
              Pum2 小鼠进行交配获得基因型为 R26⁃ER Cre/+
                            -/-
              Pum1 flox/flox  Pum2 的雄鼠，注射他莫昔芬建立了诱导              ④2N HCl 37 ℃ 30 min；⑤0.1 mol/L Borax 10 min，
              性全身Pumilio 基因敲除小鼠模型，通过PCR、West⁃                   ddH2O 2 min×3；⑥50 mmol/L Tris⁃HCl（pH=7.6）
              ern blot 和 RT⁃PCR 技术表征各组织敲除效果，以及                  5 min×2，ddH2O 2 min×3；⑦封闭、抗体孵育、显色、
              对重要器官重量、睾丸病理改变、生殖细胞增殖和                            苏木素染色、脱水、封片。
              凋亡等结果进行分析，探索他莫昔芬诱导的小鼠各                            1.2.3 Western blot检测小鼠主要脏器的敲除效率
              器官中 Pum1 敲除情况和雄性生殖系统受到的影                               取小鼠脑、胸腺、心、肝、脾、睾丸各约10 mg，分
              响，为深入研究Pumilio在出生后的功能和肿瘤治疗                        别加入约200 μL RIPA强裂解液，匀浆后冰上裂解，
              提供了重要依据及关键的研究工具。                                  每 10 min 漩涡震 1 次，共 3 次，冰上静置 20 min，
                                                                4 ℃，20 000 g 离心 30 min 后取上清液即总蛋白。
              1  材料和方法
                                                                浓度为10%的单一胶分离蛋白，湿转到硝酸纤维素膜
              1.1  材料                                           （nitrocellulose filter membrane，NC）上，用含6%脱脂奶
                            T2
                  R26⁃CreER 小鼠购自美国麻省理工大学的Tyler                  粉的TBST封闭1 h，然后加入抗PUM1（1∶500）抗体在
              Jack实验室。Pum1诱导性敲除小鼠是在Pum1基因                       4 ℃孵育过夜。次日用TBST液洗3次，每次10 min，
              的第9和第10号外显子的两端插入loxp序列，Pum2                       加入二抗后室温孵育1 h，ECL化学发光仪曝光。
                                                  表1 小鼠基因型测定引物序列
                                          Table 1 Sequences of primers used for genotyping
                    引物名称                          引物序列（5′→3′）                                 产物
                  KOF1（P1）                  CAT GAG TTT GGG AGG CAT TT                361 bp for Pum1⁃WT allele
                  KOR1（P1）                  GTG GCT AAC AAC TGC TGC AA                453 bp for Pum1⁃Flox allele
                  LOXGTR（P1）                GTC TTG TGG CAA CTA GGG TA                557 bp for Pum1⁃homo allele
                  XE⁃F（P2）                  ACC AGC GTT TCT GGG TGA                            —
                  XE⁃R（P2）                  AAA TGG CAC CCA TCA TTG TT                460 bp for Pum2⁃WT allele
                  XE⁃KOR（P2）                CCG TTG TCT GCA GTG TCT GT                280 bp for Pum2⁃homo allele
   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27