Page 23 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第8期 梁海波，邓晓凤，臧 敏，等. Pumilio家族基因诱导性敲除小鼠模型的构建［J］.
2023年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（8）：1055-1060 ·1057 ·

1.2.4 Real⁃time PCR法测定 作为对象（图 1A）。实验前将 10 mg 他莫昔芬在无
采用 TRIzol 方法抽提 RNA，用 TaKaRa 逆转录 菌环境下溶于1 mL花生油，将同批出生的多只3周
试 剂 盒 进 行 单 链 cDNA 的 合 成（20 μL 体 系 ； 和 8 周龄 R26⁃CreER Pum1 flox/flox Pum2 小鼠，采用
-/-
T2
37 ℃ 15 min；95 ℃ 5 s），在 Real⁃time PCR仪器系统 单纯随机法分为对照组和实验组，实验组注射
上（条件95 ℃ 3min；95 ℃ 15 s；65 ℃ 30 s；95℃ 15 s； 100 mg/kg 体重的他莫昔芬，对照组注射等量的花
40 个循环）进行扩增，检测 Pum1 基因的表达水平， 生油，3 周小鼠持续注射 5 d，8 周小鼠持续注射 7 d
把GAPDH作为内参，利用2 -ΔΔCt 值进行分析。 （图 1B）。
1.2.5 诱导敲除小鼠构建 1.3 统计学方法

flox/flox -/- 所有实验数据均采用GraphPad Prism软件进行
将成年雄性 Pum1 Pum2 小鼠与雌性 R26⁃
CreER 小鼠交配获得杂合子小鼠，进一步用雄性杂 统计分析，计量资料采用均数±标准差（x ± s）进行描
T2
-/-
合子与 Pum1 flox/flox Pum2 雌鼠交配得到 R26⁃CreER T2 述，指标间的比较采用成组 Student’s t 检验分析，
-/-
Pum1 flox/flox Pum2 小鼠，本研究选择此基因型的小鼠 P < 0.05为差异有统计学意义。
A
×
T2
♂ Rum1 flox/flox Rum2 -/- ♀R26⁃ER Cre/Cre

×
T2
F1： ♂ R26⁃ER Cre/+ Rum1 flox/+ Rum2 +/- ♀Rum1 flox/flox Rum2 -/-

F2： ♂ R26⁃ER Cre/+ Rum1 flox/flox Rum2 -/-
T2
B
3 w
3 w
Date of birth 3 w
Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day8 Day26

period of treatment sacrifice group 1 sacrifice group 2
2 w 3 w
Adult
Date of birth 8 w Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day7 Day21 Day42

period of treatment sacrifice group 1 sacrifice group 2
A：小鼠交配策略图；B：他莫昔芬注射方案示意图。
图1 小鼠交配策略及他莫昔芬注射方案
Figure 1 The strategy of mouse breeding and tamoxifen injection
（557 bp）。对比左侧的对照组小鼠条带，右侧两泳
2 结 果
道为两只不同敲除组的结果，在他莫昔芬注射后，
2.1 3周小鼠诱导敲除Pumilio后睾丸重量减小，无 敲除组出现了敲除条带。Western blot 结果显示胸
长形精子产生 腺、心脏、肝脏和睾丸组织的Pum1蛋白水平分别下
T2
-/-
3 周 R26⁃CreER Pum1 flox/flox Pum2 实验组小鼠 降了 48%、62%、24%和 46%（图 2B）；Real⁃time PCR
每天注射100 mg/kg他莫昔芬花生油溶液，对照组小 显示小脑、胸腺、肝脏和睾丸的Pum1表达量分别下
鼠注射等量的花生油，连续注射 5 d，在注射结束的 降了62%、89%、76%和54%（图2C）。结合睾丸组织
第 3 天和第 21 天收取小鼠各组织。PCR 琼脂糖凝 的Pum1免疫组化，能够看到注射他莫昔芬后，小鼠
胶电泳如图所示（图2A），下方的条带（453 bp）代表 睾丸组织Pum1蛋白含量明显下降（图3A）。在他莫
含有 2 个 loxp 位点的等位基因，其上方为敲除条带 昔芬注射结束的第3天对小鼠体重称量和取材后发