Page 28 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第8期
               ·1062 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年8月


                  近年来肺癌的发病率日益增加，根据 WHO 国                        癌和白血病等癌症的进展相关               ［13-15］ 。但ZDHHC9在
              际癌症研究机构统计，2018 年新增肺癌患者 209 万                      肺癌，特别是 NSCLC 发生发展中的作用尚不清楚。
              例（占癌症病例 11.6％）和 1 769 万例肺癌死亡病例                    本研究探索了ZDHHC9蛋白对NSCLC细胞增殖、迁
             （占全部肿瘤死亡患者 18.4％），肺癌也是全球癌症                         移和侵袭的影响，并探讨其可能的机制，为 NSCLC
                            ［1］
              致死的首位原因 。据统计，2020年，中国肺癌新发                         的治疗提供新的思路。
              病例总数约 82 万，肺癌成为最常见的恶性肿瘤，占
                                                                1  材料和方法
              中国癌症死亡率的23.8% 。肺癌类型中，约90%是
                                    ［2］
              非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，NSCLC），         1.1  材料
              生存率低且预后较差。在过去20年里，针对NSCLC                              正常支气管上皮细胞系 16HBE 和 NSCLC 细胞
              的分子靶向疗法和免疫疗法显著提高了 NSCLC 的                         系（A549、H1299、H1703）均购自上海中国科学院生
              治疗效果，但是耐药性的出现影响了NSCLC的治愈                          物化学与细胞生物学研究所，由本实验室保存。
                        ［3］
              率和生存率 。因此，进一步探究与NSCLC发生、发                              DMEM 培养基、胎牛血清（GIBCO 公司，美国）；
              展相关的功能基因，探索新的发病机制和治疗靶点                            TRIzol Reagent总RNA提取剂、脂质体 Lipofectamine
              具有重要意义。                                           2000（Invitrogen 公司，美国）；HiScript Ⅲ RT Super⁃
                  棕榈酰化修饰是指长链脂肪酸（通常是指16个                         Mix 逆转录试剂盒、AceQ qPCR SYBR Green Master
              碳的棕榈酸）通过硫酯键共价修饰到蛋白质半胱氨                            （南京诺唯赞生物科技有限公司）；CCK8试剂盒（上
              酸残基上，是一种广泛存在于生物体内动态、可逆                            海碧云天）；CALNEXIN 抗体（ENZO 公司，美国）；
              的翻译后修饰形式，在调控蛋白质的转运、细胞定                            FASN 抗体（10624⁃2⁃AP，上海 Proteintech）；ACC 抗
              位和稳定性等方面都具有非常重要的作用，参与诸                            体（#3662，CST 公司，美国）；ACLY 抗体（sc⁃517267，
              多生物学过程 。催化棕榈酰化的酶属于蛋白质酰                            Santa Cruz公司，美国）；HRP⁃羊抗鼠二抗（Jackson公
                          ［4］
              基转移酶（protein acyltransferase，PAT）家族，含有            司，美国）；ECL发光液（上海天能）；引物由上海捷瑞
              DHHC（Asp⁃His⁃His⁃Cys）序列，所以称为 DHHC⁃                基因有限公司合成，干扰 RNA（siRNA）由广州市锐
              PAT。由于 DHHC 基序形成锌指结构域，因此编码                        博生物科技有限公司设计合成。
              这些酶的基因称为锌指 DHHC（ZDHHC）。现已发                        1.2  方法
              现24种人类ZDHHC基因，命名为ZDHHC1~24。棕                      1.2.1 细胞培养和siRNA转染
              榈酰化通过两步机制进行。第一步是 DHHC 基序                               A549、H1703 细胞用添加了 10%胎牛血清、抗
              中的半胱氨酸残基被来自棕榈酰⁃CoA 的棕榈酸酰                          生素⁃抗真菌素的高糖 DMEM 培养基在 37 ℃ 5%
              化，形成酰基酶中间体，这一步通常称为自棕榈酰                            CO2湿化空气中培养。收集处于对数生长期的细胞，
              化。第二步是将棕榈酰基部分转移到蛋白质底物                             使细胞浓度达到6×10 个/mL，按2 mL/孔将细胞铺于
                                                                                    4
              中的半胱氨酸巯基上 。                                       细胞培养板中，待次日细胞密度达到 80％~90％时使
                                 ［5］
                  越来越多的研究表明多种疾病与蛋白质棕榈                           用 Lipofectamine 2000 按照说明书进行转染。
              酰化有关，如病毒感染、神经系统疾病、免疫疾病及                                靶向 ZDHHC9 的 siRNA 序列如下：siZDHHC9⁃
              肿瘤的发生发展        ［6-9］ 。ZDHHC酶在肿瘤中的作用十              1：5′⁃GGAACACCTTTTGCTGTGA⁃3′；siZDHHC9⁃2：
              分复杂，按照目前的研究结果，可将其分为肿瘤抑制                           5′⁃CTACAGCCATGGCAATATT⁃3′；siZDHHC9⁃3：5′⁃

              因子、癌蛋白和预后标志物。胃腺癌中发现ZDHHC2                         CGCCTCGTATCAAGAATTT⁃3′。
              低表达，并与淋巴结转移相关，在高转移性小鼠结                            1.2.2 RNA提取和实时定量PCR
              直肠腺癌模型中也发现 ZDHHC2 表达较低，因此                              收取细胞或相关转染后的细胞，使用 TRIzol 试
              ZDHHC2可以作为肿瘤抑制因子 。ZDHHC酶也可                        剂按产品说明书提取总 RNA，-80 ℃保存备用。按
                                          ［10］
              以被视为一种癌蛋白，如ZDHHC11在非小细胞肺癌                         照逆转录试剂盒 HiScript Ⅲ RT SuperMix 说明书进
              和高级别膀胱癌的5号染色体上发生了扩增 。在                            行 cDNA 合成，用 AceQ qPCR SYBR Green Master 试
                                                      ［11］
              神经胶质瘤细胞中，高水平的ZDHHC5提示较差的                          剂盒检测相关基因表达，以β⁃actin作为内参基因。
              预后，而ZDHHC5的过表达由肿瘤抑制蛋白p53的致                             PCR条件：95 ℃预变性，10 min；95 ℃变性，15 s；
              癌突变驱动 。ZDHHC9是ZDHHC家族中的一员，                        60 ℃退火延伸，60 s；循环 40 次。2           - ΔΔCt  方法用于
                        ［12］
              研究表明其通过发挥棕榈酰化酶的作用与乳腺癌、肾                           RNA 水平表达量分析。引物序列如下：ZDHHC9上
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