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第43卷第8期 周 容，高琛梓，赵廷枫，等. 棕榈酰化转移酶9调控非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭及相关机制研究［J］.
                  2023年8月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（8）：1061-1067                      ·1063 ·


                游引物：5′⁃CCCAGGCAGGAACACCTTTT⁃3′；下游引                PBS 吸去漂浮的细胞，两组尽量选择相似的区域且
                物：5′⁃CCGAGGAATCACTCCAGGG⁃3′；β⁃actin上游             宽度一样的地方作为起始点，观察 24~48 h，用照相
                引物：5′⁃TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC⁃3′；下              机记录伤口愈合的情况。
                游引物：5′⁃TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG⁃3′。              1.3  统计学方法
                1.2.3 细胞蛋白提取及Western blot                             实验数据采用 Graphpad Prism 8.0 统计软件进
                    细胞板中加入适量 RIPA 裂解液，用细胞刮将                       行统计分析并制图。实验结果以均值±标准差（x ±
                细胞充分刮下放入1.5 mL EP管中，4 ℃ 12 000 r/min              s）表示。对于两组间的比较，使用t检验来确定是否
                离心10 min，小心转移上清至另一套EP管中用BCA                       具有统计学意义，使用 ANOVA 单因素方差分析进
                法进行蛋白浓度测定；在蛋白原液中加入 5×上样                           行多组间的比较。每组实验均重复3次，P < 0.05为
                缓冲液，混匀离心放入 95 ℃金属浴 10 min，储存                      差异有统计学意义。
                于-80 ℃冰箱。
                                                                  2  结 果
                    Western blot：用 8% SDS⁃PAGE 胶进行分离，并
                转 移 到 PVDF 膜 上 ，膜 用 TBST buffer（10 mmol/L         2.1  ZDHHC9 在非小细胞肺癌组织和细胞系中表
                Tris，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween⁃20，pH 7.2~7.6）    达水平升高
                配制的5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，然后加入相应抗体                             首先，通过生物信息技术在 NCBI datasets GEO
                4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后，加入HRP标记二抗室温                       数据库（GSE31210）中分析了肺癌临床样本和正常
                孵育1 h，最后用ECL 发光试剂盒显色。用Image J 对                   肺组织样本，结果显示与正常肺组织相比，ZDHHC9
                条带进行灰度分析，计算蛋白的相对表达量。                              在肺癌临床分期ⅠA、ⅠB、Ⅱ阶段中表达量升高
                1.2.4 细胞CCK⁃8增殖实验                                （P < 0.000 1，图 1A）。为了进一步确定 ZDHHC9 在
                    收集处理完毕的细胞悬液，再用牛鲍板进行细                          正常的肺部组织细胞和 NSCLC 细胞中的表达水平
                胞计数，经计算配制成 2 000 个/mL 细胞的细胞悬                      是否存在同样差异，检测3种NSCLC细胞系（A549、
                液，铺入 96 孔板中，每孔 100 μL，以 10 μL 体积的                 H1299、H1703）中 ZDHHC9 相对于支气管上皮细胞
                CCK⁃8（Cell Counting Kit⁃8）试剂加入到每个孔中。             （16HBE）的表达量，发现 ZDHHC9 在 3 种 NSCLC 细
                37 ℃避光反应 1 h，反应结束后把细胞板放入酶标                        胞系中均表达升高（P < 0.001，图1B）。
                仪中震荡10 s，分别在450 nm和690 nm处读值并计                    2.2  ZDHHC9 表达水平升高与非小细胞肺癌预后
                算细胞的增殖能力。                                         不良相关
                1.2.5 Transwell实验                                     通过 GEPIA 网站（http：//gepia.cancer⁃pku.cn/）
                    收集处理好的细胞于1.5 mL EP管中，1 500 r/min              分析评价ZDHHC9表达与NSCLC患者预后的关系，
                离心 5 min，用高糖无血清培养基洗 2~3 次，用 1 mL                  结果显示 ZDHHC9 表达量与 NSCLC 总生存期没有
                高糖无血清培养基重悬细胞混匀；用牛鲍板进行计                            差异（图 2A），但与 NSCLC 的无病生存期有显著差
                数，将细胞（5×10 个细胞用于迁移实验；1×10 个细                      异，ZDHHC9 高表达组的预后显著低于低表达组
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                胞用于侵袭实验）加在 Transwell 小室的正上方（进                    （HR=1.4，P=0.008 5，图2B）。以上结果表明ZDHHC9
                行侵袭实验要在 Transwell 小室上方中加基质胶），                     在肺癌患者中表达明显上升且其表达水平与NSCLC
                小室的底部刚好浸入 500 μL 20％的血清培养基                        患者的预后不良密切相关。
                中。培养 24 h 后，用药棉擦去上层膜上残留的细                         2.3  敲降ZDHHC9抑制非小细胞肺癌细胞增殖
                胞。先用多聚甲醛进行细胞固定 30 min，再用结晶                            为了深入了解 ZDHHC9 在 NSCLC 发生发展中
                紫对小室底部的细胞进行 60 min 染色，最后用                         的作用，选用2种NSCLC细胞系H1703和A549，设计
                ddH2O清洗3遍，风干，用倒置显微镜对小室底部的                         3条干扰RNA（siZDHHC9）进行敲降，Real⁃time qPCR
                细胞进行拍照并用软件对细胞数进行统计。                               验证敲降效率。发现干扰后，ZDHHC9 的 mRNA 水
                1.2.6 划痕实验                                        平较对照组均明显降低（P < 0.01，P < 0.001，图3A、
                    在6孔板的底部平均划6条横线随后将细胞按                          B）。后续我们选择siZDHHC9⁃2开展相关实验。为
                照每孔2×10 个细胞数铺于6孔板中，贴壁后分别转                         确定ZDHHC9对细胞增殖的影响，利用CCK8法检测
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                染相应小干扰 RNA。48 h 后用 10 μL 的枪头在 6 孔                 了ZDHHC9敲降后的细胞增殖活力，结果表明，敲降
                板中划 3 条竖线（尽量保证竖线的宽度相等）。用                          ZDHHC9 能显著抑制 H1703 细胞（图 3C）和 A549 细
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