Page 54 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第8期
               ·1088 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年8月


              30 s、72 ℃ 30 s（三步骤循环40次），95 ℃ 15 s，60 ℃           相关关系，发现两者呈正相关（P＜0.01，图3）。
              60 s，95 ℃ 15 s。所有样品均以GAPDH作为内参进                   2.2  Gas6与肾病综合征
              行3次以上 qRT⁃PCR 实验，并以 2         -ΔΔCt 计算 mRNA 的          为了进一步探究Gas6与NS的关系，用0.2 μg/mL
              相对表达水平。相关指标的引物序列见表2。                              的 ADR 作用于 MPC5 细胞以构建研究 NS 的典型细
                                                                胞模型，即阿霉素肾病细胞模型，NPHS1（Nephrin）
                           表2 qRT⁃PCR引物序列
                     Table 2 Sequences of qRT⁃PCR primers       与 NPHS2（Podocin）表达下调为模型构建成功的标
                 名称                   序列（5′→3′）                 志。通过 qRT⁃PCR 和 Western blot 检测到在该模型
                                                                中Gas6表达升高（P＜0.01和P＜0.05，图4）；并且用
               TFAP2A      上游引物：CGCCGATCCATGAAAATGCT
                           下游引物：TAAGGATCTTGCGACTGGGG            Gas6 细胞因子直接作用于 MPC5 细胞，通过 qRT⁃
               Gas6        上游引物：TGGCATGTGGCAGACAATCT            PCR 和 Western blot 检测到 NS 相关指标 Nephrin 与
                           下游引物：ATACCTCCCACGGTCAGGTT            Podocin表达下调（P＜0.05或P＜0.01，图5）。
               GAPDH       上游引物：GAGTCAACGGATTTGGTCGT
                                                                2.3  Gas6与凋亡
                           下游引物：TTGATTTTGGAGGGATCTCG
                                                                     为了探究 Gas6 与凋亡的关系，用 Gas6 细胞因
               Bax         上游引物：CCGTTCTGATTCTGCACCCT
                                                                子作用于HEK⁃293T细胞，通过qRT⁃PCR和Western
                           下游引物：GGGGTTGATACCACGATCCC
                                                                blot观察到Gas6可使凋亡相关指标BCL⁃2表达增多
               BCL⁃2       上游引物：CAACACTGGCACACAATGGG
                           下游引物：GGCCTGATTTGAGAGTGCCT            （P＜0.01 和 P＜0.05，图 6）、Bax 表达减少（P＜0.05
               NPHS1       上游引物：GTGAGGAGAGACCCTTCCCT            和 P＜0.001，图 6）；通过流式细胞术可检测到实验
                           下游引物：TAGCCAGGAAGGATGGTTGC
                                                                组凋亡细胞较对照组明显减少（P＜0.001，图6）。
               NPHS2       上游引物：AAAGACAAGCCAAAGTGCGG
                                                                2.4  TFAP2A是否与Gas6启动子结合
                           下游引物：TCTGCCCAGTGCCTAATGAA
                                                                     为了探究 TFAP2A 是否与 Gas6 启动子结合，用
              1.2.8 蛋白免疫印迹（Western blot）                        HEK⁃293T细胞进行了ChIP实验，结果表明TFAP2A
                  在 6 孔板（2×10 个/孔）中进行与上述提取总                     抗体所沉淀蛋白可结合在 Gas6 的启动子区的扩增
                                 5
              RNA 前相同的实验，48 h后使用总蛋白提取试剂盒                        序列上，而对照抗体 IgG 不能沉淀结合该序列的蛋
              从细胞系中提取总蛋白，加入5×上样缓冲液混匀并                           白，即 TFAP2A 在 Gas6 启动子区有结合位点（P＜
              100 ℃煮沸8~10 min。制备10% SDS⁃PAGE凝胶，进                0.05，图7）。
              行电泳，电泳条件：90 V 30 min，120 V 40 min。电泳              2.5  检测人 Gas6 启动子、突变启动子活性以及
              完成后用快速转膜液常温恒流400 mA，30 min将蛋                      TFAP2A对其活性的影响
              白转至 PVDF 膜，室温封闭 2 h 后 4 ℃孵育一抗过夜                        将合成的pGas6⁃1450和pGas6⁃1450 mut重组质
             （12~16 h），TBST 洗膜 3 次（30 min/次），室温孵育二              粒进行序列测定，结果提示与目标序列完全一致，
              抗 2 h，再洗膜 3 次后曝光显影。以 GAPDH 作为内                    说明人 Gas6 启动子及转录因子结合位点突变启动
              参，实验独立重复3次以上。                                     子的萤光素酶报告基因重组质粒构建成功。在
              1.3  统计学方法                                        HEK⁃293T 细胞中进行双萤光素酶报告基因实验，
                  采用GraphPad Prism6及SPSS 25.0软件对数据进             检测到与pGL3⁃Basic组相比，pGas6⁃1450组的HEK⁃
              行统计分析。实验结果以均数±标准差（x ± s）表示，两                      293T 细 胞 的 相 对 萤 光 素 酶 活 性 明 显 增 加（P＜
              组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。                        0.001）；与 pGas6⁃1450 组相比，pGas6⁃1450 mut 组的
                                                                HEK⁃293T细胞的相对萤光素酶活性有不同程度的
              2  结 果
                                                                降低（P＜0.05和P＜0.001）；在转染了pGas6⁃1450质
              2.1  生信分析                                         粒的HEK⁃293T细胞中，与siNC组相比，siTFAP2A组
                  用GEO数据库分析NS病理表型之一的肾小球                         的 HEK⁃293T 细胞的相对萤光素酶活性明显降低
              硬化的高表达（红色）及低表达（绿色）基因，Gas6属                        （P＜0.01），与pENTER组相比，pENTER⁃TFAP2A组

              于高表达基因（图 2）；用 JASPAR 数据库和 PROMO                   的 HEK⁃293T 细胞的相对萤光素酶活性明显增加
              数据库预测 TFAP2A 在 Gas6 启动子上的结合位点                     （P＜0.001）；在转染了pGas6⁃1450 mut质粒的HEK⁃
              并取交集，得到多个结合位点（以此设计突变位点）；                          293T 细胞中，与对照组相比，siTFAP2A 组的 HEK⁃
              用GEPIA数据库分析Gas6和TFAP2A在肾皮质中的                      293T 细胞的相对萤光素酶活性略微降低（P＜0.05）
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